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祁连山高寒草地土壤微生物群落结构及功能类群研究

康文龙  
【摘要】:祁连山脉是黄土高原、青藏高原和蒙新荒漠的交汇点,是我国西北干旱区和半干旱区的过度带,独特的地理环境造就了其特殊的生态环境,是我国重要的生物资源库和基因库。草原是我国面积最大的陆地生态系统,随着气候的变化和人为的影响,草原荒漠化成为全球面临的主要环境问题之一。土壤微生物与地上植物之间通过植物根系的传递而有着密切的相互联系,而植物对全球生态系统的平衡有着直接的影响。高寒草地是祁连山重要的生态系统之一,研究该区土壤微生物的群落结构和功能类群对维护高寒草地生态系统有着极其重要的意义,而且可以获得该地区独特的微生物基因资源的信息,为进一步开发高寒草原微生物资源有重要的意义。本研究选取了四个海拔高度和土壤深度不同的12个土样,运用微生物培养技术、荧光定量PCR和Biolog实验方法,研究微生物群落结构,旨在全面了解该地区的微生物生态特征;并对氮循环的两种最重要的基因:固氮基因(nifH)和氨氧化基因(amoA)进行了克隆文库的构建,旨在探索该地区氮循环关键基因的分布和结构特征。取得了以下研究结果。 1.研究区土壤理化性质最主要的特征是pH值都大于8.0,属于典型的碱性土壤,而且随着土壤深度的加深pH值呈增大趋势。综合看来,研究区海拔最低的土壤的肥力较低。 2.随着土壤深度的增加可培养微生物数量减少,海拔对微生物数量的影响不明显,功能微生物数量大小关系是:氨化细菌好氧自生固氮菌硝化细菌解磷菌好氧反硝化细菌。土壤理化性质对微生物数量影响最明显的是土壤pH值,其对好氧反硝化细菌、硝化细菌和解磷菌有明显的负面影响。硝化细菌生长对其他功能微生物生长都表现出极显著的正面影响,表明硝化作用是氮循环中最重要的作用之一。这是因为氨氧化作用是氮循环中的限速反应而影响了其他氮循环功能微生物的生长。 3.荧光定量PCR研究结果表明,微生物类群的基因拷贝数大小关系为:细菌古菌固氮菌氨氧化古菌真菌氨氧化细菌。细菌基因拷贝数在1.19×10~9-4.79×10~9之间,古菌基因拷贝数在5.14×10~6-6.28×10~7之间,真菌基因拷贝数在1.00×10~5-7.23×10~6之间,固氮菌基因拷贝数在2.19×10~6-3.45×10~7之间,氨氧化古菌的基因拷贝数在6.83×10~4-1.34×10~7之间,氨氧化细菌的基因拷贝数在1.03×10~3-1.87×10~5之间。固氮微生物、氨氧化细菌和古菌三个氮循环相关的微生物在海拔最低的样点拷贝数最少,氨氧化古菌基因拷贝数明显大于氨氧化细菌的基因拷贝数,说明研究区域的氨氧化作用主要是靠氨氧化古菌来完成的。 4. Biolog研究表明,土壤微生物利用碳源的优先顺序总体上为:糖类脂类氨基酸类。对碳源的利用量随着土壤深度的增加而减少,土壤微生物对碳源的利用能力表现为高海拔区高于低海拔区,且随着土壤深度的增加而减少。随着培养时间的延长,碳源总体利用量在增加。Shannon指数无明显差异,说明不同土样中微生物的种群多样性基本相同,但高海拔土样的Mcintosh指数明显大于比低海拔土样,说明高海拔土壤微生物均一度较好,对碳源的利用程度大。 5. nifH和amoA基因克隆文库研究表明,固氮基因nifH中蓝藻门(Cyanobacteria)相似序列占41%,厚壁菌门(Firmicutes)相似序列占14%,变形菌门(Proteobacteria)相似序列占8%,其余为未知菌株(Unidentified bacterium)。在土样AQ1中发现了一条新的nifH基因序列AQ1-12(KC41210~9),在土样AQ4中发现了三条新的nifH基因序列,分别为AQ4-3(KC412133)、AQ4-4(KC412134)和AQ4-5(KC412135),说明在祁连山高寒草原土壤中存在着独特的固氮微生物资源。 通过荧光定量PCR和克隆文库实验表明,研究区氨氧化细菌对氨氧化作用贡献比较小,所以只构建了氨氧化古菌amoA基因的克隆文库。其中氨氧化古菌中未培养泉古菌门(Uncultured Crenarchaeote)占到大多数,其余为未培养奇古菌门(UnculturedThaumarchaeote),而大多数其他研究在很多土壤中只发现了泉古菌门,说明祁连山高寒草原土壤中有着丰富的氨氧化古菌资源。


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