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青海湖发光细菌的分离和鉴定及对兽药的毒性评价

卓平清  
【摘要】:发光细菌是一类能发生生物发光现象的细菌,其中大部分生活在海洋中,淡水则很少见。发光细菌对污染物很敏感,已广泛应用到各个领域,尤其是环境污染物的监测中。目前世界上唯一的一个无致病性的淡水型发光细菌——青海弧菌是我国朱文杰教授在青海湖裸鲤体表分离得到的。但关于在青海湖裸鲤内脏器官、青海湖其它动物、不同深度的湖水以及底泥中是否可以分离得到发光细菌,目前还没有进行过研究。总之,目前对青海湖及其周边的补给河中发光细菌的生态分布研究还是一个空白。青海湖水咸化碱化导致青海湖地区生态环境不断恶化,而发光细菌的生态分布特点能直接体现湖水的质量,但这方面的研究更是空白。 本文用传统的分离培养技术,在不同的季节,从青海湖的主湖及其外围7条补给河的表层沉积物、不同深度的湖水以及底泥中分别取样;在青海湖裸鲤和花斑裸鲤体表和内脏器官分别取样,分离发光细菌,鉴定到种,探明青海湖中发光细菌的种类和数量。通过分析青海湖及其周边补给河水体及其底泥中离子的成分探讨青海湖及其补给河环境是否适应发光细菌的生长,揭示青海湖中发光细菌的生长与环境因子的相关性,探讨高山湖泊中发光细菌多样性与其受污染程度的关联性,为评价湖泊的生态环境寻找新的途径。用发光细菌法检测了11种天水地区常用的兽药毒性。为建立基于有特定生态功能的发光细菌检测水污染的技术提供科学依据。研究结果不仅可以解决发光细菌在高原湖泊中的种群分布规律以及和环境关系这样的科学问题,而且为淡水发光细菌的进一步推广应用奠定坚实的基础。 本文从青海湖及其7条补给河河/湖水、底泥、青海湖裸鲤的体表和内脏器官分离发光细菌,结果只在青海湖裸鲤体表和内脏中分到了16株发光细菌,同时对青海湖及其补给河水体、底泥中离子成分进行了分析,其结果表明,在各水体中青海湖主要以Na+-Cl-离子的形式存在,主要的阳离子为Na+ Ca2+Mg2+K+,倒淌河的盐度则仅次于青海湖,在剩余的补给河中,布哈河虽比青海湖和倒淌河的盐度低很多,但比其它的河流略大;黑马河、布哈河、沙柳河和哈尔盖河以Ca2+Mg2+≈Na+≈Cl-为主要离子存在,其中黑马河中的Ca2+含量最高,但青海湖水体中绝大部分离子浓度均比其补给河高。在各底泥金属元素成分研究中,青海湖及其补给河底泥中金属元素成分主要为Ca、Fe、Mg、K和Na,在各底泥样品中,Ca含量均是最高的,其含量为:哈尔盖河布哈河泉吉河江西沟沙柳河倒淌河青海湖,且湖水底泥中上述元素大部分比河水底泥平均元素含量低,特别是K、Na、Ca和Mg的差异较大。 从青海湖裸鲤体表及内脏器官中共分到16株发光细菌,编号依次为Q1~Q16。16株发光细菌细胞壁革兰氏染色均为阴性,细胞为杆状,大小为(0.5~0.8)μm×(1.0~1.5)μm,具有单极生鞭毛,有运动性。氧化酶和接触酶均呈阳性反应,能发酵葡萄糖产酸,吲哚试验和V-P试验均为阳性反应,能分泌淀粉酶、明胶酶、DNA酶,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐,最适生长温度为20~25℃,最适生长pH为8.5~9.0。16S rDNA基因序列分析结果表明:16株发光菌与其亲缘关系最近的属为Vibrio(弧菌属),该属内和本实验的16株发光菌亲缘关系最近的种Vibrio anguillarum(鳗弧菌)的16S rDNA序列相似值为99.57%。Biolog Gen Ⅲ鉴定结果显示,本实验的16株发光菌在有氧件下,在提供的71种碳源中,只能利用其中的30种,其中糖类12种,氨基酸类5种,羧酸类4种,聚合物类2种,其它类7种。结合16株发光菌的形态学特征、生理生化特性、Biolog Gen Ⅲ鉴定结果和分子生物学特性,将菌株鉴定为Vibrio anguillarum。对具有代表性的一株体表菌命名为鳗弧菌Q1,有代表性的一株内脏菌命名为鳗弧菌Q3。通过研究Q1和Q3的最适温度及最适pH,结果Q1和Q3的最适生长温度均为20℃~25℃,最适生长pH均为8.5~9.0。 以鳗弧菌Q1和Q3为测试菌株,0.85%NaCl溶液为背景溶液,暴露时间15min(磺胺类30min),用BHP9511型发光仪测定了11种兽药不同质量浓度下的相对发光率及其EC50(即半数抑制效应质量浓度)值,研究11种兽药对Q1和Q3的急性毒性效应和作用规律。其结果表明,在所研究的质量浓度范围内,11种兽药与Q1、Q3表现良好的相关性,且总体影响基本一致,11种兽药对鳗弧菌Q1和Q3的相对发光率随兽药质量浓度的增加而降低。在暴露时间为15min时,11种兽药对鳗弧菌Q1的毒性大小依次为氧氟沙星乙酰甲喹恩诺沙星烟酸诺氟沙星头孢噻呋钠氟苯尼考盐酸林可霉素磺胺间甲氧嘧啶钠硫酸链霉素磺胺嘧啶钠磺胺对甲氧嘧啶钠;11种兽药对鳗弧菌Q3的毒性大小依次为氧氟沙星乙酰甲喹恩诺沙星烟酸诺氟沙星头孢噻呋钠氟苯尼考盐酸林可霉素硫酸链霉素磺胺间甲氧嘧啶钠磺胺嘧啶钠磺胺对甲氧嘧啶钠。不同兽药对鳗弧菌Q1和鳗弧菌Q3急性毒性不同,基本上喹诺酮类对鳗弧菌Q1和鳗弧菌Q3的急性毒性大于抗生素类,而磺胺类对鳗弧菌Q1和鳗弧菌Q3的急性毒性最小,在同一类兽药中,对鳗弧菌Q1和Q3的急性毒性也存在一定的差异,有些种类的兽药差异很大,且同种兽药对鳗弧菌Q1和鳗弧菌Q3的急性毒性也不同,但差异并不太大。


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