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根际放线菌次级代谢产物及其生物活性研究

郭新东  
【摘要】:抗生素主要来源为动植物和微生物生长过程中产生的次级代谢产物。抗生素在临床上常被用于治疗由细菌感染所引起的疾病,由于人们对抗生素的滥用使得病原菌在抗生素的长期刺激下发生突变,能够与抗生素共生从而使得抗生素失去药效。因此开发新型抗生素迫在眉睫,目前发掘抗生素的主要手段是通过研究微生物的次级代谢产物。在微生物中,放线菌分布最广,安全性较高便于研究。研究表明药用植物的根际常与周围的土壤进行物质交换,所以此间的微生物数量较多,其中活性放线菌的数量较多,因此药用植物的根际土壤成为研究热点。本实验选用采集于新疆天山地区大叶橐吾根际土壤进行实验。对采集到的5份根际土壤进行分离纯化得到26株放线菌,记录各个菌的形态。选用8株真菌对26株放线菌进行抗真菌实验,其中放线菌AH1901-2对镰刀菌的抑菌效果最好,最大抑菌半径为23 mm,放线菌AH1901-7和AH1902-9也具有一定的抑菌效果。对得到的三株放线菌进行TLC检测发现AH1901-2代谢产物的含量和种类最多,选用AH1901-2为目标菌株,并进行了小规模的发酵筛选出的发酵条件为36℃培养15 d,发酵量为100 L。对得到的放线菌AH1901-2进行小规模液体发酵得到菌体,提取菌体的DNA进行PCR扩增后,进行16S测序,选取与放线菌AH1901-2基因序列同源性较高的30株菌进行系统发育树进行构建,确定AH1901-2属于网状链霉菌。对放线菌进行基因框架图测序,将测序得到基因序列经过拼接、组装剔除其中无效的基因片段得到新的基因序列其总长度为9442504 bp,GC含量为73%。对基因序列预测的蛋白的功能、病原和宿主相互作用分别进行了注释。运用anti SMASH对得到的基因序列进行基因簇分析,得到43基因簇及每个基因簇对应化合物类型。其中Cluster 4和Cluster 34的代谢产物类型为萜类,预测两个基因簇合成的化合物分别为Geosmin、albaflaveone;Cluster 9、Cluster 19和Cluster 29的代谢产物类型为I型聚酮(T1PKS),预测三个基因簇合成的化合物分别为sanglifehrim A、sceliphrolactam、Naphthomycin A;Cluster 27的代谢产物类型为外泌素类化合物,预测其合成的化合物为ectione,并对上述预测的化合物做出生物合成途径的分析。将线菌AH1901-2置于36℃的恒温箱里培养15 d得到次级代谢产物22 g。将得到粗提物用反复的柱层析和高效液相色谱仪进行分离纯化得到9个单体化合物AH-01~AH-09。并对这9个化合物进行结构解析得到化合物AH-01为Germicidin B、AH-02为Germicidin A都属于属于不饱和内酯。AH-03为trans-dehydrocurvularin、AH-04为curvularin、AH-08为Brefeldin A都属于大环内酯类化合物。AH-05为Naphthomycin A、AH-06为Naphthomycin L都属于安莎霉素类化合物,其中Naphthomycin A是Cluster29预测的代谢产物。AH-07为Vineomycin B_(2,)属于蒽醌类化合物。AH-09为对羟基苯乙酮属于芳香族化合物。对AH-05、AH-06进行细胞毒性实验,发现AH-05人体肝细胞(LO_2)和人体乳腺癌细胞(MCF-7)的IC_(50)值分别为11.32±0.42μM、11.24±0.07μM,AH-06对四种细胞的IC_(50)值均20.00μM。结果说明化合物AH-05对乳腺癌细胞有一定抑制作用,能够为治疗乳腺癌提供研究基础,而AH-06基本无细胞毒性。


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