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牛朊蛋白基因PrP102-242和PrP1-264在COS-7细胞中的表达

丁耀忠  
【摘要】:【目的】朊病毒(Scrapie Prion Protein, PrPSc)是疯牛病等海绵状脑病的致病因子。PrPSc是由正常的细胞型朊蛋白(Cellular Prion Protein, PrPC)通过空间构象转变产生的,PrP27-30是PrPSc的具有感染性的核心片段。PrPC由一个正常的内源性基因Prnp编码,充分了解PrPC的结构与功能有助于揭示PrPSc的致病机制。尽管PrPC在脑组织内富集,但是不易提取,限制了研究。为了克服这一难题,采取哺乳动物细胞表达系统表达出具有天然构象的PrP是当前研究PrPC的有效手段。本研究旨在实现两种牛朊蛋白编码基因PrP102-242(成熟的PrP,编码PrP27-30)和PrP1-264(由成熟的PrP、N端信号肽和C端GPI锚构成)在COS-7细胞中的表达,以期为牛PrPC的结构与功能研究以及免疫学诊断奠定物质基础。 【方法】利用PCR技术从连有目的片段的克隆载体上扩增PrP102-241和PrP1-264的编码序列,并用EcoRⅠ和SalⅠ分别对两个目的片段和pCI-neo载体进行双酶切,连接转化,并利用PCR、双酶切初步鉴定后,通过序列测定证明获得阳性重组质粒。利用脂质体介导方法将两个阳性重组质粒分别导入COS-7细胞后,依次用浓度为100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL和400ug/mL的G418加压筛选,获得稳定表达的阳性细胞株。RT-PCR检测外源基因转录水平,然后用抗PrP特异性单克隆抗体(7B6/D2)作为检测探针,分别用间接免疫荧光、间接ELISA和Western-blot检测两个不同长度的PrP基因在COS-7细胞内的转录水平和表达水平。 【结果】PCR、双酶切以及测序的结果表明,牛PrP102-242和PrP1-264的编码基因被正确插入真核表达载体pCI-neo,构建的重组质粒分别被命名为pCIneo-PrP102-242和pCIneo-PrP1-264。脂质体介导的两个重组质粒转染COS-7细胞后,经4个浓度的G418加压筛选和亚克隆后,获得了两株的抗性细胞株,分别被命名为7B2和30C1。RT-PCR检测表明两个重组质粒所携带的外源基因被整合到宿主细胞基因组中并可以正常转录。用抗PrP的特异性单克隆抗体(7B6/D2)作为检测探针,间接免疫荧光检测表明已经整合到宿主细胞基因组中的外源基因可表达。间接ELISA检测结果表明2陪稀释的阳性细胞株7B2和30C1细胞裂解液ELISA值分别达到1.095和1.259。筛选药物G418在100ug/mL到400ug/mL范围内,7B2和30C1表达水平呈正相关当G418在100ug/mL至400ug/mL范围时,细胞株7B2和30C1表达水平与G418的浓度呈正相关。SDS-PAGE和Western-blot分析表明7B2和30C1表达分子量分别为18.0kD和35.0kD,并能与PrP单抗(7B6/D2)发生特异反应。 【结论】本研究成功构建两个两个不同长度的牛PrP基因的真核表达载体PCI-PrP102-242和PCI-PrP1-264;经G418加压筛选获得了两株表达量较高的抗性细胞株7B2和30C1,其中细胞株7B2可表达重组蛋白PrP102-242,细胞株30C1可表达重组蛋白PrP1-264。间接免疫荧光、间接ELISA和Western-blot检测表明所筛选的7B2、30C1均能与PrP单抗(7B6/D2)反生特异性反应。


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