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东祁连山高寒草地土壤优良解磷细菌的研究

叶震  
【摘要】:本研究根据高寒草地不同植被类型,选取了有代表性的7个样地,即杜鹃灌丛(Rhododendron fruticosa shrub land)、高山柳灌丛(Salix cupularis fruticosa shrub land)、金露梅高寒灌丛(Dasiphoru fruticosa shrub land)、珠芽蓼草地(Polygonum grassland)、禾草草地(Grass grassland)、沼泽草地(Swamp grassland)和嵩草草地(Kobresia grassland)。采用微生物学方法和分子生物学方法对其表层土壤中解磷细菌进行分离,并对其解磷能力和解磷机制进行了初步研究,选取其中解磷能力强的菌株对其培养条件进行了探索。并采用分子生物学方法对解磷能力强的菌株进行了16SrDNA序列测定,确定其系统分类学地位。研究结果如下: 1.高寒植被土壤解磷菌的筛选及解磷能力测定 采用PKO培养基从各样地土壤中共分离获得解磷细菌共计36株,根据对其菌落形态特征和菌体染色观察确定菌株Y5、Y14、Y15在两个样地中均能分离得到,因此共计分离得到菌株33种。经牛肉膏蛋白胨培养基上继代培养20代,其中有20株解磷菌解磷能力明显下降,占总解磷菌的60.61%,解磷能力丧失较严重,其余13株解磷菌采用解磷圈法测定D/d值,结果显示对Ca_3(PO_4)_2均有溶解作用,8d后D/d值在1.21~4.01之间,但溶解效果差异较大。其中解磷效果最好的(D/d值≥4)有1株,占总数的7.69%;解磷效果好的(2≤D/d4)有8株,占总数的61.54%;效果一般的(1.5≤D/d2)有2株,占15.38 %;解磷效果较差的(D/d1.5)有1株,占7.69 %。对13株解磷菌采用摇瓶培养定性测定其对Ca_3(PO_4)_2的溶解能力,结果表明:菌株间解磷能力差异较大,菌株Y2解磷效果最好;其次是Y5、Y6、Y11等3个菌株,而Y20、Y21、Y28、Y15等解磷能力较弱。 2.优良解磷菌株对磷矿粉溶解能力测定 从13株解磷菌中选择解磷能力较强的4株菌株,测定其对3种磷矿粉(磷矿粉Ⅲ、磷矿粉Ⅳ、磷矿粉ⅩⅢ)的溶解能力。结果表明:各菌株对磷矿粉Ⅳ的溶解能力普遍较好强,同等条件下,较磷矿粉Ⅲ要高0~3个百分点,而较磷矿粉ⅩⅢ要高0~7个百分点;各菌株均在15℃~30℃下解磷能力较好,解磷温度范围较宽。其中Y1在20℃对各磷矿粉溶解能力均最强,Y2在15℃时解磷效果最好,Y3、Y4在20℃具有最佳的解磷能力。各菌株30℃对各磷矿粉溶解能力均开始下降,35℃时达到最低。 采用砂培法,测定4株解磷菌对各磷矿粉释放、储存及同化情况,结果显示:解磷菌不仅可以将转化的磷素直接释放到环境中,还可以将一部分磷素储存在体内作为自身磷源,另外还有部分被同化用于自身生长需要。但各菌株对3种磷矿粉的释放、储存、同化量各不相同。对于磷矿粉Ⅲ和磷矿粉Ⅳ,各菌株将溶解后的磷素大部分直接释放到环境中。而对于磷矿粉ⅩⅢ,菌株Y1、Y3、Y4将大部分溶解的磷素同化到体内,仅有菌株Y2将溶解磷素的73.12%储存的在细胞内作为自身磷源。 3.解磷菌解磷动态与解磷机制的初探及其培养条件筛选 选择解磷效果最佳组合即菌株Y1与磷矿粉Ⅳ的组合测定解磷动态和解磷机制。菌株Y1在8d时,D/d值达到最大值3.94,之后D/d值不在发生较大变化,解磷效果趋于稳定。定量测定其解磷动态时,菌株Y1在96h后解磷效果达到最大值,培养液中有效磷含量高达3.995mg,但总体上菌株Y1在24h~168h过程中,溶解释放的有效磷量基本保持恒定。 菌株Y1溶解磷矿粉Ⅳ的解磷机制进行初探结果显示:菌液培养36h后,对照中有效磷含量为5.171mg,酸处理中有效磷含量为7.547mg,酶处理中有效磷含量为8.666mg,酸和酶共同作用有效磷的含量为7.316mg。可见在解磷菌Y1溶解磷矿粉Ⅳ过程中,酶解的作用最强,有机酸在磷矿粉溶解过程中也起着积极的作用,且菌株Y1分解的有机酸溶解磷矿粉的能力较无机酸的溶解能力强。 对解磷菌Y1的摇瓶培养条件进行初步筛选,结果表明:菌株Y1摇瓶发酵的最佳条件为,温度:15℃~30℃;培养基成分:玉米粉1%、荞面1%;pH值7.5;装液量250ml三角瓶中装50ml。 4.解磷菌的形态特征及16S rDNA的鉴定 通过对解磷菌形态和染色反应观察,结果表明:13株分离物以革兰氏阴性菌为多数,共计10株,占总数的76.92%。菌落形态多样,有杆状、短杆状、球形、椭圆形、近球形;颜色以白色居多,多数半透明,少数菌体内具有芽孢。对其中解磷能力强的4株菌株,即Y1、Y2、Y3、Y4进行16S rDNA的分子鉴定,其中Y2、Y3、Y4等3个菌株分别与Erwinia billingiae (登录号AM055711.1)、Pseudomonas reactans(登录号DQ257418.1)、Serratia plymuthica(登录号EF064206.1)的同源性均为99%,因此,初步确定Y2、Y3、Y4分别为Erwinia billingiae、Pseudomonas reactans、Serratia plymuthica。而菌株Y1基因序列测定未成功,有待进一步测定。


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