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解磷根瘤菌诱变选育及抗污染菌剂制备关键技术研究

李剑峰  
【摘要】:磷是植物生长必需的主要营养元素,由于72%到90%的土壤磷会被土壤中的钙、铝、铁离子和有机化合物所固定,使土壤磷缺乏成为限制农产品产量和质量的重要因素。苜蓿和红豆草作为最重要的牧草,栽培面积超过两百万公顷,占全国近四分之三的人工草地。产量集中于西北高原干旱半干旱地区的谷物作物轮作区。土壤全磷含量随磷肥的不断施用而逐渐增加,但作物及牧草依旧由于有效磷过低而产生明显的缺磷症状。解磷微生物能够分解土壤中的难溶性无机磷供植物吸收利用,其中的解磷根瘤菌作为一种同时具备解磷和结瘤固氮作用的植物促生菌,对豆科作物的生长和产量有很好的促进作用,能够减少磷化肥的施用,并降低农业生产的成本。但目前解磷根瘤菌剂的应用受到下列因素的限制:1.菌种的选育效率较低,筛选出的菌种综合促生能力不高。2.菌种的应用范围仅限于其寄主植物。3.国内外根瘤菌剂普遍存在污染率高、功能单一、保质期短和占瘤率低的问题。由于解磷根瘤菌本身会分泌有机酸,因此更容易造成菌剂产品的酸化,引起菌体的死亡和杂菌的侵入;4.目前采用的通用泥炭载体基质为不可再生资源,其采集过程会对产地的生态环境造成破坏,而泥炭菌剂也存在一些质量上的缺陷。 针对上述问题,本研究从以下方面进行了探讨:1.优化解磷根瘤菌的筛选方法和菌种的诱变增效;2.将能够解磷并有分泌生长素能力的根瘤菌作为根际解磷固氮促生菌在非寄主植物上应用,拓宽其应用范围;3.利用抑菌剂降低根瘤菌剂的污染率,提高根瘤菌活菌数和目标根瘤菌的占瘤率;4.以青秸秆粉浸提液作为解磷根瘤发酵培养基,降低菌剂生产成本。并以黄绵土和秸秆粉代替泥炭载体作为固体菌剂载体基质,降低根瘤菌菌剂制备的经济成本和环境成本。根据这样的指导思想和目标,本研究在逐级分离、定向选育的方法筛选出有利用潜力的解磷分泌生长素根瘤菌Rhizobium. Meliloti L-5和Rhizobium sp.RS-1菌株的基础上,通过微波诱变和验证选育得到两株原始菌株的增效耐药突变株Rhizobium. meliloti LW107和Rhizobium sp.RSW96,使菌株的解磷和分泌生长素能力得到增强,并获得对两种抗生素的抗药标记特性。经过遗传稳定性验证后,在以难溶性无机磷为唯一磷素来源的栽培条件下考察诱变选育得到的解磷根瘤菌突变株LW107和RSW96对寄主及非寄主植物的促生性能。在抗污染菌剂的试制过程中,利用突变株的耐药特性,以其耐受的氨苄青霉素作为抑菌剂,进行不同浓度氨苄青霉素对菌株和寄主植物幼苗的毒性测验,优化出液体菌剂的最适抑菌剂浓度和含药菌剂施用时的最佳稀释度。为了最大程度的降低菌剂成本并提高其质量,本研究优化出最适于解磷根瘤菌发酵培养的碳源种类,讨论了调整成份后的青秸秆粉浸提液作为解磷根瘤菌液体发酵培养基和固体培养基的可行性。随后以灭菌的玉米青秸秆粉、黄绵土以及常用的泥炭和蛭石进行载体基质的筛选,试制出含抑菌剂的解磷根瘤菌液体菌剂和固体菌剂,经不同贮存时期进行菌剂性质的测定和验证,得到性质稳定、造价低廉、污染率低、有效期长的解磷根瘤菌剂及其制备工艺的关键技术。 研究的主要结果如下: 1.以固氮菌-解磷固氮菌-解磷根瘤菌的逐级筛选模式可以从豆科植物根瘤内分离得到具有良好促生性能的解磷根瘤菌。以该方法筛选出的苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti L-5和红豆草根瘤菌Rhizobium sp. RS-1均为快生型根瘤菌,具有结瘤固氮能力较强的特点,兼备解磷和产生长素的特性,耐盐和耐酸碱能力强,可以作为高效解磷根瘤菌进一步选育的基础材料。 2.根瘤中可溶解无机磷的解磷固氮菌株以土壤杆菌、放线菌、芽孢杆菌、氮单胞杆菌和其他固氮菌属中的菌株为主,经回接鉴定的根瘤菌仅有5株,仅占总固氮菌株数的1.78%。表明根瘤内有大量无结瘤能力的解磷固氮菌存在。 3.采用菌株诱变的方法,可利用已有菌种资源,提高菌种选育效率,弥补野生菌种解磷能力弱的缺陷。作为一种简便、安全、清洁、廉价的辐射源,微波辐照诱变的条件更易于掌控和变更。本研究中随着诱变目的和根瘤菌株的不同,具体的最佳微波辐照参数有较大差异,但最高正突变率均出现于致死率为87%-90%之间的辐照处理。经诱变得到的部分高效突变菌株存在遗传基因不稳定、出现回复突变或产量下降的现象,需验证至少6代菌体的遗传稳定性。 4.在仅提供难溶性无机磷的栽培条件下,所有植物都表现出明显的生长受抑,叶片生长迟缓、颜色变深,根系变细。具备产生长素能力的解磷根瘤菌对寄主和非寄主植物有良好促生效果,能有效解除寄主和非寄主植物的缺磷胁迫,促进植株生长量和生物量的增长,提高氮素和磷素的吸收。解磷根瘤菌通过溶解难溶性无机磷解除寄主或非寄主植物遭受的缺磷胁迫,使之进入相对均衡的营养环境,同时侵染寄主植株产生根瘤固氮。对非寄主植物,解磷根瘤菌具有根际解磷菌相似的特性,但接种于寄主植物时,植株的叶面积、地上及地下生物量干重、根瘤个数、根瘤直径等均优于接种的非寄主植物。 5.在低磷条件下,普通根瘤菌依然具备侵染寄主植株并结瘤固氮的能力,但根瘤直径、鲜重和固氮酶活性明显下降。缺磷胁迫下接种普通根瘤菌12531的植株生长状况优于未接种根瘤菌也未施用可溶性磷素的处理CK1,但单叶面积仅分别为接种LW107、RSW96菌株和施用1/4量可溶性磷素处理(CK2)的65.9%、79%和67.4%。接种普通根瘤菌12531的植株生物量干重较CK1处理增加35.93%,但仅为接种解磷根瘤菌LW107和RSW96处理的73.1%和85.29%,也低于施用化学磷肥的处理17.92%。 6.氨苄青霉素作为具有低毒性的抑菌剂,低剂量时刺激植物生长而高剂量时产生毒害效应。200mg/L以上剂量氨苄青霉素能够抑制根瘤菌诱导植株结瘤使根瘤数量减少,根瘤剖面颜色变浅,个体变小,固氮酶活性降低至其正常根瘤的1/5以下。低浓度的氨苄青霉素对结瘤和固氮酶活性无抑制作用,还能提高植株结瘤的数目。由于物种间存在差异,苜蓿和红豆草对于同一氨苄青霉素浓度的反应并不相同。 7.保存120d、以泥炭、蛭石、秸秆粉和黄绵土为载体基质的固体菌剂中,活菌数随菌剂载体吸附菌液量的增多而升高。由于青秸杆粉疏松多孔,可吸附达自重2.7倍的菌液,并含有大量适于微生物生长的氮源、核酸、可溶性糖和几乎菌种所需的全部矿质元素。菌种进入载体后继续大量繁殖,保存120d时的最大有效菌含量达到泥炭菌剂的155.48%和138.44%,用于菌剂载体有很大潜力。但贮存1a后,由于解磷根瘤菌酸性代谢物的过量积累,使pH值显著降低,杂菌数量上升而根瘤菌数急剧下降。比较发现,黄绵土载体制备的菌剂中LW107和RSW96菌株的有效菌含量显著高于其他载体基质(P0.05),泥炭载体次之。黄绵土和泥炭基质菌剂的主要性状都达到微生物菌剂国家标准,可以作为菌剂载体基质利用。黄绵土基质由于价格低廉,原料易得,贮存后活菌数量高而杂菌率低,性质稳定,具有良好的应用潜力。 8.秸秆粉浸提液培养基(CSE)中的碳源和磷素营养都能被菌体很好的利用。补充葡萄糖并调整pH后的秸秆粉浸提液培养基(CSE-2,青秸秆粉与H2O的比例为1:50)适用于LW107菌株的液体发酵,在降低菌剂成本的同时加快菌液的发酵速度,优于通用的YEM培养基;CSE-2中1:100的青秸秆粉浸提液(CSE-3)加入葡萄糖和琼脂后制成的固体培养基对根瘤菌的平板培养效果等同或优于标准YMA培养基,可以作为根瘤菌平板培养的高效廉价培养基。 9.降低温度和添加抑菌剂均能提高根瘤菌剂中的有效菌数,降低杂菌率并维持菌剂内pH值的稳定。温度对长期保藏菌剂(1a)的活菌数和污染率影响最大,抑菌剂次之,4oC低温下保存抑菌剂可以有效提高活菌数,并使杂菌的数量得到有效控制;室温下菌剂中的菌体代谢活跃,有机酸积累量高,pH值偏低,而低温保存或添加抗生素的菌剂则pH值相对稳定。解磷根瘤菌菌剂贮藏1a后的pH值大小顺序为:低温贮藏的含抗生素菌剂常温贮藏的含抗生素菌剂低温贮藏的普通菌剂常温贮藏的普通菌剂。 10.以对300mg/L氨苄青霉素和80mg/L卡那霉素的双抗药性和解无机磷特性作为解磷根瘤菌高效突变株的标记特征,获得的菌株可以通过观测解磷透明圈、含药平板甄别的方式进行示踪和检测,使菌剂中目标菌和杂菌的测定过程得以简化,也使含抑菌剂的抗污染剂型制备和目标菌的占瘤率测定得以实现。 11.以乙炔还原法测定固氮酶活性时发现,由于缺乏厌氧环境或低氧环境对固氮酶的保护,根瘤菌纯培养物的固氮酶活性远低于其诱导植物形成的根瘤,但源于同一原始菌株的突变株纯培养物固氮酶活性和其同一寄主的根瘤固氮酶活性间,存在正相关,且苜蓿根瘤菌L-5和红豆草根瘤菌RS-1的突变株系都得到一致的结果。这一现象值得进一步研究和发掘,可对高效固氮根瘤菌突变株的快速选育提供借鉴。


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