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动物狂犬病基因工程亚单位疫苗研究

殷相平  
【摘要】:狂犬病是由狂犬病毒感染引起的人兽共患传染病,一旦感染,很难治愈。采用疫苗接种是预防和控制狂犬病的最有效的手段,目前我国动物用狂犬病疫苗主要是传统弱毒疫苗和灭活疫苗,弱毒疫苗存在潜在的安全隐患,灭活疫苗生产成本昂贵难以大规模免疫接种。本研究采用家蚕杆状病毒表达体系,以蚕蛹为生物反应器高效表达了狂犬病毒CVS毒株核蛋白、糖蛋白,同时通过基因重组技术实现狂犬病毒糖蛋白和核蛋白在家蚕蚕蛹中的共表达,并分别对表达产物的免疫原性进行了研究。 1、本试验利用家蚕杆状病毒表达体系成功地表达了狂犬病毒核(N)蛋白,并对免疫原性进行了分析。从感染了狂犬病毒CVS毒株的小鼠脑组织中经RT-PCR克隆出N基因,通过设计特异性酶切位点将其与杆状病毒转移载体pVL1393粘性链接,然后与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA在家蚕细胞(Bm-N)中共转染,通过空斑筛选,获得携带N基因的重组家蚕核型多角体病毒-rBmNPV(N)。间接免疫荧光试验表明N蛋白在Bm-N细胞中获得成功表达; Western blotting检测结果表明,目的蛋白的分子量与预期相符,约为54KD;用ELISA测定N抗原在蚕蛹中的表达水平,试验表明蚕蛹中N抗原的效价可达1:50000左右。采用疫苗注射、重组抗原注射免疫的小白鼠,均产生较高水平的抗狂犬病毒的特异性抗体,抗体亚型检测表明N蛋白主要诱导细胞免疫反应,免疫后28天用10LD_(50)的狂犬病毒攻击,分别获得80%和50%的免疫保护。 2、本试验利用家蚕杆状病毒表达体系成功地表达了狂犬病毒糖(G)蛋白,并对免疫原性进行了分析。采用家蚕杆状病毒表达技术路线,最终获得携带G基因的重组家蚕核型多角体病毒-rBmNPV(G)。间接免疫荧光试验表明,G蛋白在Bm-N细胞中获得成功表达;用Western blotting检测,结果表明表达的G蛋白的分子量与预期相符,大小约为63KD;用ELISA检测,蚕蛹中表达的G抗原的效价可达1:8192左右。将G抗原与油佐剂按一定的比例制成疫苗。采用疫苗注射、重组抗原注射免疫的小白鼠,均产生较高水平的抗狂犬病毒G蛋白的特异性抗体,抗体亚型结果表明,糖蛋白主要诱导机体产生体液免疫反应。免疫后28天用10LD_(50)的狂犬病毒攻击,均获得100%的免疫保护。 3、本试验利用家蚕杆状病毒表达体系成功地在家蚕蚕蛹中共表达了狂犬病毒G蛋白和N蛋白。为了实现G蛋白和N蛋白在家蚕杆状病毒中的双表达,在两个基因之间插入一段核糖体结合位点序列,并成功构建重组杆状病毒转移载体pVL-G-IRES-N。经共转染和空斑筛选等一系列试验最终获得携带G基因和N基因的重组家蚕核型多角体病毒-rBmNPV(G-IRES-N)。用Western blotting检测,双表达抗原中出现与预期相符的G蛋白和N蛋白目的条带,大小分别为63KD和54KD;用ELISA法检测,能够分别检测到G抗原和N抗原在蚕蛹中的表达,两种抗原的效价均可达1:8192左右。表达时相研究表明,重组病毒接种蚕蛹后4~5d时表达量达到最高水平。用表达抗原与油佐剂按一定的比例制成疫苗。经小白鼠和犬的安全试验表明用该抗原制备的疫苗对小白鼠和犬是安全的。采用疫苗注射、重组抗原注射免疫的小白鼠,均产生较高水平的抗狂犬病毒的特异性抗体,抗体亚型结果表明,G/N双表达抗原可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应,免疫后28d用20LD_(50)狂犬病毒攻击,均获得100%保护。


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