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百脉根和白三叶根际溶磷菌筛选、溶磷特性与促生效应研究及其16S rDNA序列分析

李显刚  
【摘要】:对贵州黔南地区百脉根和白三叶根际溶磷菌进行分离,采用溶磷圈法初选溶磷菌,钼蓝比色法测定溶磷菌株溶解磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝及蛋黄卵磷脂能力;Salkowski比色法测定溶磷菌株分泌3-吲哚乙酸(IAA)能力;常规法测定菌株碳源利用及8株溶磷菌对白三叶苗期促生效果;盆栽条件下测定溶磷菌剂、固氮菌剂和溶磷+固氮菌处理对百脉根和白三叶的促生效果;利用16SrDNA分子生物学方法初步鉴定了3株优良溶磷菌。获得以下结果:1.溶磷菌在百脉根与白三叶根际数量分布特征 从百脉根和白三叶根际分别获得溶磷菌20株和16株;两种牧草根际溶磷菌数量分布特征:根表土壤(RS)远根土壤(NRS)根面(RP)≧根内(HP)。2.溶磷菌溶磷特征 不同溶磷菌株在以磷酸钙为磷源的PKO固体培养基及以蛋黄卵磷脂为磷源的蒙金娜固体培养基上产生的透明圈直径(HD)/菌落直径(CD)比值差异较大。在磷酸钙(生长第五天)为磷源的PKO培养基上,HD/CD值在2.36~4.39之间;在蒙金娜培养基上,HD/CD值在1.04~1.72之间。多数溶磷菌株的HD/CD值在菌株生长第五天时达到最大,随后逐渐变小。 供试的19株溶磷菌对磷酸钙(Ca-P)溶解能力差异较大,溶磷量在94.35~400.49mg·L~(-1)之间。溶磷量大于200.00mg·L~(-1)的菌株有8株,占供试菌株的42.11%。菌株LC15的溶磷量最大。8株溶磷菌具有溶解磷酸铝(Al-P)、磷酸铁(Fe-P)及蛋黄卵磷脂(EYPC)能力,其中菌株LC15对Al-P的溶解能力最强,为71.22mg·L~(-1);菌株LC25对Fe-P的溶解能力最强,为27.27mg·L~(-1);8株溶磷菌对EYPC中磷的溶解量在1.88~19.54mg·L~(-1)之间,菌株LC20对EYPC溶解能力最强,菌株RW6仅对EYPC有微弱溶解能力。除菌株RW2与RW6外,其余6株溶磷菌对Ca-P、Al-P、Fe-P及EYPC的溶解能力强弱为:Ca-PAl-PFe-PEYPC。3.溶磷菌分泌3-吲哚乙酸(IAA)的能力 供试的19株溶磷菌中,15株能分泌IAA,占供试菌株的78.94%,但各菌株分泌IAA量差异较大,在9.17~42.39mg·L~(-1)之间,分泌IAA能力最强的是菌株LC20,其次为菌株LC19(38.97mg·L~(-1))。4.溶磷菌的碳源利用与酸碱性能 多数菌株均能在以甘露醇、蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、半乳糖及1/2甘露醇+1/2蔗糖为碳源的培养基上茂盛生长或良好生长。所有供试菌株均为产碱菌。5.菌株促生效果(1)单菌株对白三叶苗期生长的影响 8株溶磷菌接种于白三叶幼苗,经40d生长,株高、根长、地上生物量和地下生物量较对照分别提高9.50%~110.98%、1.91%~89.17%(除菌株LC16)、4.66%~242.22%和8.20%~346.17%(菌株RW2除外)。(2)复合菌株处理对百脉根及白三叶生长促生效果 接种不同复合菌株处理(溶磷菌剂、固氮菌剂和溶磷+固氮混合)与对照相比,百脉根株高及地上生物量提高明显。无论第一茬还是第二茬,溶磷+固氮混合处理的株高均较对照显著提高超过20.00%,地上生物量较对照增加均超过100.00%;溶磷+固氮混合处理对百脉根体内全氮及粗蛋白、全磷含量提高最高,分别较对照增加19.34%和61.88%;溶磷菌剂处理的粗脂肪含量较对照显著提高25.08%。 与对照比较,白三叶施用复合菌株的株高、地上生物量、全氮及粗蛋白含量、全磷与粗脂肪含量差异较大。两茬中,溶磷+固氮混合处理对株高与地上生物量影响效果最好,分别比对照增加超过10.00%和40.00%;溶磷菌剂处理的全氮及粗蛋白含量均较对照提高7.00%以上,全磷与粗脂肪含量分别增加19.23%和7.07%;溶磷+固氮混合处理对白三叶粗脂肪含量影响不明显。6.菌株的16SrDNA序列分析 LC15、LC20与RW18三菌株基因组DNA经PCR扩增16SrDNA序列、阳性克隆检测、质粒提取测序、并与GenBank中已知序列比对,结果表明菌株LC15与LC20的16SrDNA序列与多株克雷氏菌属(Klebsiellasp.)的16SrDNA核苷酸序列的同源性均超过99.00%,RW18与勒克氏菌属中的Leclerciaadecarboxylata(HQ242722)核苷酸序列同源性为99.79%。依据比对结果,结合各菌株的主要生理生化特征,将菌株LC15与LC20初步鉴定为Klebsiellasp.;菌株RW18鉴定为Leclerciasp.。


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