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肺巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

潘阳阳  
【摘要】:猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)是重要人畜共患病病原菌,主要致人和猪肺炎、败血症、脑膜炎、多器官功能衰竭综合征及突发性死亡等,严重危害人类健康,造成养猪业严重的经济损失,对公共卫生和食品安全构成严重威胁,受到世界各国的高度重视。为探明猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage,PAMs)在SS2引致肺炎过程中发挥的作用,本实验进行了如下研究: (1)SS2感染小型猪肺炎模型的建立:据预实验,选取6头SPF巴马小型猪,5头用于实验组,分别肌肉注射1109CFU mL-1的SS2菌液2mL,1头对照猪注射等体积生理盐水;记录死亡时间,并观察死亡前小型猪的临床症状变化;剖解病死猪,观察肺部病变;随机取部分肺组织计算肺脏的湿干重比值,分析其与死亡时间的关系;取病变肺组织进行组织病理学观察;制作冰冻切片,用SS2荧光抗体检测SS2在肺组织中定位和菌量。结果显示,实验组2头小猪在6h内发生急性死亡,且死亡前没有任何神经症状,只有呼吸异常症状,肺脏的湿干重比值最大。另3头分别在感染12h,20h和36h死亡,死亡前具有SS2典型的神经和呼吸异常症状,肺脏的湿干重比值也随之减低,可见死亡越早肺水肿程度越严重。病死猪肺组织病理学观察显示,肺泡的间隔增宽,出血,有大量炎性渗出,肺泡腔内可见数量不等的红细胞,中性粒细胞,淋巴细胞和浆液性渗出物等典型间质性肺炎特征症状。SS2荧光抗体检测显示SS2可侵入肺组织的各个部位,并且在6h和20h菌量接近。表明SS2感染时,巴马小型猪肺部症状和病程典型,适宜作为肺炎模型。 (2)SS2体外感染不同时间诱导PAMs凋亡和坏死:用MOI=100︰1的SS2分别感染PAMs1、2、4、6、12h,瑞氏-吉姆萨染色光镜下观察PAMs形态变化;Hoechst33258和PI染色荧光显微镜下观察PAMs形态学变化;流式细胞仪分析PAMs的凋亡与坏死;提取细胞DNA进行凝胶电泳检测。结果显示,细胞凋亡和坏死的濒率随感染时间的延长而上升。PAMs体外经SS2感染1h,几乎没细胞发生凋亡;感染2h,可诱导PAMs发生凋亡,凋亡和坏死总比率高达32.16%,其中约11.31%的PAMs坏死,表明此条件下细胞炎症反应已经开始;感染4h,39.47%的细胞发生坏死,坏死和凋亡细胞的总比率为66.75%左右;感染6h,60.16%的细胞发生坏死,坏死和凋亡细胞的总比率达到89.31%;在感染12,几乎所有细胞坏死,细胞炎症反应达到最大程度。结果表明,SS2体外感染诱导PAMs凋亡和坏死是一个快速、高频率的过程,PAMs在SS2感染过程中主要功能为介导炎症反应。 (3)肺泡巨噬细胞在SS2引致肺炎过程中的起始作用:用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪PAMs,(a)以10倍递增的SS2︰PAMs感染比(Multiplicity of infection,MOI),分别为1︰10~1000︰1,感染12h;(b)以MOI=100︰1分别感染1、2、4、6、12、24h, ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的含量及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,和对照组之间均差异极显著(P0.01),各浓度和时间点之间均差异显著(P0.05);同时PAMs形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损或频死细胞产生。MOI为1︰1感染12h,或MOI为100︰1感染6h的条件下均可致70%PAMs崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100︰1,感染12h,此时镜下细胞几乎100%崩解死亡,表明PAMs的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而达到最大程度。综合分析,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。


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