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棉花GhGME基因的克隆及其表达分析

王江英  
【摘要】:本研究根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3’,5’-RACE技术,从棉花叶片中克隆出GDP-甘露糖-3’,5’-异构酶(GDP-mannose-3’,5’-epimerase,GME)基因,命名为GhGME。利用荧光定量qRT-PCR方法对棉花根、茎、叶和低温、盐及GA3三种胁迫处理下该基因的表达特性进行了分析。将GhGME基因构建到pGEM-T载体上,得到重组质粒pGEM-T-GhGME,经双酶切,将目的基因GhGME分别与表达载体pET-23b、pBin438定向连接并构建原核表达载体pET-23b-GhGME和真核表达载体pBin438-GhGME。通过电击法将pET-23b-GhGME导入大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)中进行酶蛋白的蛋白诱导和分离表达;将pBin438-GhGME导入农杆菌菌株(Agrobacterium tumefacious)LBA4404中制备工程菌,通过农杆菌介导法,获得转基因烟草植株并测其抗坏血酸含量。得出以下实验结果: 1.利用3’,5’-RACE技术,参照TaKaRa5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE KitUser Manual,以“中棉所35”的RNA进行cDNA第一链的合成,根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,进行目的片段5’和3’末端的扩增。将5’-RACE和3’-RACE产物电泳检测,回收,连接到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌感受态DH5α细胞,通过蓝白斑筛选,挑取PCR检测得到的阳性克隆进行测序。将测序结果用DNAMAN进行拼接,结果表明GhGME基因全长1467bp,开放阅读框1131bp,编码376个氨基酸,预测的分子量为42.396KDa,等电点pI=6.291。 2.利用荧光定量qRT-PCR方法对棉花根、茎、叶和三种处理下该基因的表达特性进行分析,得出GhGME基因在根、茎中高水平表达,在叶中表达量较低。在4℃低温和200mmol/L NaCl处理下该基因表达上调,然而用100μmol/L GA3处理则表现为下调表达。 3.双酶切克隆载体pGEM-T-GhGME和表达载体pET-23b,回收目的基因以及载体片段,定向连接后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,成功构建原核表达载体pET-23b-GhGME,经酶切鉴定,目的片段已分别定向连接到表达载体pET-23b中。通过热击法将pET-23b-GhGME导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG进行蛋白诱导,诱导出大小为42.4KDa的GME蛋白,并纯化出该蛋白。 4.双酶切克隆载体pGEM-T-GhGME和表达载体pBin438,回收目的基因以及载体片段,定向连接后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,成功构建真核表达载体pBin438-GhGME,经双酶切鉴定,目的片段已分别定向连接到表达载体pBin438中。采用电击法将pBin438-GhGME导入农杆菌LBA4404中制备出工程菌,通过农杆菌介导法,将pBin438-GhGME转入烟草中,获得批量转化植株,对经PCR和RT-PCR检测呈阳性的7株转基因植株进行抗坏血酸含量的测定,结果表明转基因植株的抗坏血酸最高量可达对照组的2.3倍。


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