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奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌与无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的研究

张亚茹  
【摘要】:奶牛乳房炎是一种对奶牛养殖业造成严重经济损失的常见多发病。国内外学者研究表明,引起奶牛乳房炎的病因非常复杂,但病原菌感染是最主要的病因,其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌感染是最主要的病原菌。由于奶牛乳房炎治疗过程中抗生素滥用,造成乳汁中药物残留和细菌耐药性的增加,使得抗生素治疗效果下降,因此,用疫苗预防奶牛乳房炎成为国内外学者研究的热点。本项研究选用临床分离筛选的毒力和免疫原性强的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)J581株和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)A20株优势血清型菌株作为制苗菌株,对两种菌荚膜多糖进行提取、纯化,然后与破伤风类毒素进行偶联,制备出荚膜多糖蛋白结合疫苗,并对其免疫效果进行初步研究。研究并建立了金黄色葡萄球菌J581株和无乳链球菌A20株两种菌最佳的荚膜多糖分离纯化流程,即发酵液经甲醛灭活离心后,采用改良加酶法从菌体中提取荚膜多糖,利用Sevage法去除蛋白,然后过10KDa和30KDa进行两次超滤,超滤液过CL-4B琼脂糖凝胶柱进行纯化,得到纯化的荚膜多糖,而后以破伤风类毒素(tetanus toxoid TT)做载体蛋白,以己二酰肼(ADH)为间桥,碳二亚胺(EDAC)为交联剂,将荚膜多糖与蛋白进行偶联。然后对偶联产物经琼聚糖凝胶进行纯化,对其多糖含量进行测定,结果表明,J581荚膜多糖的终产量为49.85m g/L,蛋白含量为0.923%,核酸含量为0.867%;A20荚膜多糖含量终产量为57.05 m g/L,蛋白含量为0.917%,核酸含量为0.887%。利用紫外全波长进行扫描,对多糖蛋白偶联情况进行了鉴定,结果其最高吸收峰介于纯荚膜多糖和融合蛋白最高吸收峰之问,表明偶联成功。且当蛋白与多糖以1:1质量比混合时偶联效果最好,J581偶联物的偶联率为1.00,A20偶联物的偶联率为0.967。用PBS对制备的两种荚膜多糖蛋白结合疫苗分别进行稀释,制备出含金黄色葡萄球菌及无乳链球菌荚膜多糖多糖含量分别为5μg/m L、10μg/mL、15μg/mL的6种荚膜多糖蛋白结合疫苗,以及荚膜多糖含量分别为10μg/mL的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌混合荚膜多糖蛋白结合疫苗。将210只昆明雌鼠随机分为9个组,其中实验8个组,对照1个组,对小鼠进行了7种荚膜多糖蛋白结合疫苗和乳房炎灭活疫苗的免疫,进行了疫苗免疫后小鼠不同时间段抗体测定及Ig G的水平测定,并于免疫后35 d进行了抗人工感染效果试验。对同一种细菌的三种不同多糖含量的荚膜多糖蛋白结合疫苗及相同荚膜多糖含量的不同细菌的荚膜多糖蛋白结合疫苗免疫效果及保护率进行比较,结果表明,荚膜多糖含量为10μg/mL的蛋白合疫苗抗体效价及保护率最高,无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合苗抗体效价和保护率均高于金黄色葡萄球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗。两种菌荚膜多糖蛋白结合混合苗比单一荚膜多糖蛋白结合疫苗免疫效果要好。即两种菌混合荚膜多糖蛋白结合疫苗的抗体效价及保护率无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗金黄色葡萄球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗。本项研究建立了金黄色葡萄球菌和无乳链球菌最佳的荚膜多糖提取、纯化工艺,制备出了奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗,明确了配置疫苗最佳的荚膜多糖含量。该项研究为今后进一步深入开展乳房炎疫苗研究,进一步提高奶牛乳房炎免疫预防效果奠定了基础。


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