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奶牛乳房炎四种病原菌多重PCR检测方法的建立及应用

丁天翊  
【摘要】:奶牛乳房炎(Bovine mastitis,BM)是一种由病原微生物侵袭所造成的复杂的奶牛乳腺综合征疾病,其中亚临床型乳房炎尤为高发。亚临床型乳房炎在感染过程中无临床症状表现,因此给疾病的诊断和治疗带来了极大的困难。该病不仅造成了产奶量的巨大损失、养殖业经济效益的降低,同时也对动物和人类的健康造成了很大的影响。为了能够寻找到一种高效、敏感和特异的检测方法,提高对奶牛乳房炎发病情况及致病微生物的诊断率,本研究参照GenBank发表的序列,在大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌各自保守的16-23s rRNA区域及白色念珠菌的18s rRNA区域设计了4对特异性引物,建立了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌等4种乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法,同时本实验采集40份临床奶样,对病原菌进行了分离、培养及多重PCR检测验证了检测方法的可行性,取得结果如下:(1)对甘肃省兰州市2家奶牛场采集的40份奶样进行了细菌学检测。共检出4份含有金黄色葡萄球菌的奶样,7份含有无乳链球菌的奶样,3份含有白色念珠菌的奶样,5份含有大肠杆菌的奶样;检出率为金黄色葡萄球菌10%、大肠杆菌12.5%、白色念珠菌7.5%、无乳链球菌17.5%,其中无乳链球菌的检出率最高,混合感染率比单一菌株感染率高。(2)多重PCR最佳反应体系为:大肠杆菌cDNA模板0.6μL、上下游引物各0.3μL,金黄色葡萄球菌cDNA模板1μL、上下游引物各0.5μL,白色念珠菌cDNA模板0.4μL、上下游引物各0.2μL,无乳链球菌cDNA模板1μL、上下游引物各0.5μL,ddH_2O 4μL,Taq 2X Master Mix 10μL,反应体系总共20μL,最佳退火温度为53℃,最佳循环次数为35次。(3)多重PCR特异性检测结果显示:建立的多重PCR检测方法具有较高的特异性,各引物能且只能使对应的模板扩增出对应的阳性条带,即金黄色葡萄球菌(1319bp)、白色念珠菌(730bp)、大肠杆菌(663bp)、无乳链球菌(406bp),对其他模板高度特异。(4)多重PCR敏感性检测结果显示:建立的多重PCR检测方法具有较好的敏感性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌的最小检测浓度分别为10~2CFU/mL、10~4 CFU/m L、10~5 CFU/mL、10~2 CFU/mL。(5)临床样品检测结果:该方法能够准确检测临床样品,并且检出率与传统细菌学检测结果相符合,敏感性优于传统检测方法。


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