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青稞茎基腐病菌(Fusarium avenaceum)多样性及其寄主抗病机理的研究

漆永红  
【摘要】:青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)是禾本科大麦属的一种禾谷类作物,主要分布在我国青藏高原及辐射边缘的高寒地区,是这些区域主要的饲料作物和粮食作物,广泛用于饲草饲料、食品和酿造等。本研究在明确青稞茎基腐病发生情况、发病症状、危害程度、病原种类以及青稞根际土壤微生态的基础上,重点以优势病原菌燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)为研究对象,以抗病青稞品种NQK-01-03和感病青稞品种甘青2号为研究材料,开展青稞茎基腐病菌(F.avenaceum)多样性及其寄主抗病机理的研究,取得以下研究结果:(1)以甘肃省甘南地区和青海省已分离鉴定的91株燕麦镰孢菌为供试材料,采用SSR分子标记法进行了种群遗传多样性和毒素化学型及地理分布分析。结果表明,6对SSR引物在91株燕麦镰孢菌中共检测到等位位点数14个,多态性位点数13个,多态性条带百分率为92.86%。6个种群平均等位基因数为1.8215,有效等位基因数为1.5530,Nei's基因多样性指数为0.3156,Shannon信息指数为0.4644,多态性位点数为11.5,多态位点百分率为82.15%。6个地理种群的Nei's遗传相似度为0.8325~0.9869,遗传距离为0.0132~0.8705。种群间的遗传距离和地理距离、遗传相似度与海拔差距无显著相关性。燕麦镰孢菌种群聚分为3个大类群,GroupⅠ由甘肃省临潭县、合作市和卓尼县种群组成,GroupⅡ由青海省互助土族自治县和刚察县种群组成,GroupⅢ由青海省海晏县种群组成。燕麦镰孢菌种群的遗传变异主要来自种群内部,占总变异的93.63%。燕麦镰孢菌毒素化学型分为NIV、DON、3-AcDON三大类,没有15-AcDON毒素化学型。DON在6个不同地理均有分布。该结果为明确燕麦镰孢菌种群遗传多样性和毒素化学型及地理分布提供理论依据。(2)以荧光染料SYBR Green I为指示剂,首次建立了青稞茎基腐病快速诊断技术和燕麦镰孢菌(F.avenaceum)快速检测方法,该方法以燕麦镰孢菌的ITS序列为目的DNA片段,应用LAMP设计软件设计2条外引物和2条内引物,优化LAMP反应体系和反应条件,用2%琼脂糖凝胶电泳是否出现阶梯状条带和LAMP反应液颜色变化进行特异性和灵敏度验证,同时用LAMP反应液颜色变化进行田间发病组织检测和土壤燕麦镰孢菌灵敏度验证。优化的LAMP反应体系表明,最佳反应温度为65℃,反应程序为65℃1 h,80℃20 min。特异性检测结果表明,7个不同地理来源的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色(阳性),2%琼脂糖凝胶电泳检测均出现梯度条带,而对照和其他病原菌均呈橘色(阴性),电泳检测没有条带。灵敏度验证结果表明,LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10 pg/μL,2.0%琼脂糖凝胶电泳检测显示,100 ng/μL~10 pg/μL的模板DNA均出现梯度条带。对采自甘肃省甘南州卓尼县和临潭县的20份疑似病害样本提取的DNA进行检测,13份为阳性,该技术能够检测出青稞发病组织中的燕麦镰孢菌。在土壤中检测的灵敏度为10个燕麦镰孢菌孢子/0.25 g土壤。本方法的建立与应用为燕麦镰孢菌的检测及其青稞茎基腐病的诊断提供一种新的技术。(3)采用室内接种燕麦镰孢菌的方法,测定了燕麦镰孢菌侵染对抗病青稞品种NQK-01-03和感病青稞品种甘青2号植株叶片细胞结构、光和CO_2响应以及青稞植株叶片水分、总灰分、粗脂肪、粗纤维、粗蛋白和青稞植株全氮、全磷和全钾含量的变化规律。显微镜观察结果表明,正常的青稞叶片颜色均一且呈深绿色,而发病的青稞叶片叶脉绿色褪去,呈现黄绿或黄白交替症状,透光率增强。透射电镜观察结果表明,发病叶片细胞膜和叶绿体均遭到严重破坏和断裂,叶肉细胞皱缩变形。发病青稞叶片叶绿素含量和电解质渗漏电导率均降低。受燕麦镰孢菌侵染,甘青2号和NQK-01-03的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均降低,而胞间CO_2浓度升高;光饱和点、最大净光合速率和暗呼吸速率均降低,而光补偿点升高;CO_2饱和点降低,而CO_2补偿点和光呼吸速率升高。青稞植株叶片水分含量降低,而粗纤维含量升高。青稞植株全氮和全磷含量均降低。感病品种甘青2号的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均低于抗病品种NQK-01-03。该结果为阐明青稞茎基腐病发病机制提供理论依据。(4)选取感病青稞品种甘青2号和抗病青稞品种NQK-01-03,在室内盆栽条件下,采用苗期人工接种法来测定感抗青稞品种内部及品种之间受燕麦镰孢菌侵染后引起的植株叶片和根系MDA含量、Pro含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和CAT活性的动态变化规律,以及病健植株株高、根长和植株鲜重、根鲜重的变化情况。试验结果表明,感病青稞甘青2号病叶Pro、MDA和POD高于健叶,可溶性糖、可溶性蛋白、SOD和CAT低于健叶;病根Pro、MDA、POD和SOD高于健根,可溶性糖、可溶性蛋白和CAT低于健根。而抗病青稞NQK-01-03病叶Pro和CAT高于健叶,可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、POD和SOD低于健叶;病根Pro、可溶性蛋白、MDA和POD高于健根,可溶性糖、SOD和CAT低于健根。受燕麦镰孢菌侵染,感病青稞甘青2号和抗病青稞NQK-01-03之间病健叶和病健根生化酶活性变化结果表明,感病青稞甘青2号病叶Pro、POD和CAT高于抗病青稞NQK-01-03,可溶性糖、可溶性蛋白、MDA和SOD低于抗病青稞NQK-01-03;而感病青稞甘青2号病根Pro、MDA、POD和CAT高于抗病青稞NQK-01-03,可溶性糖、可溶性蛋白和SOD低于抗病青稞NQK-01-03。燕麦镰孢菌侵染后,感病青稞甘青2号和抗病青稞NQK-01-03的株高、根长和植株鲜重、根鲜重均减少。本研究得出,Pro含量、POD活性和CAT活性高低与青稞品种对茎基腐病的抗病性呈负相关,而可溶性蛋白含量和SOD活性高低与品种对茎基腐病的抗病性呈正相关。该结果为明确燕麦镰孢菌侵染对青稞叶片和根系生理生化机制提供理论依据。(5)以抗病青稞品种NQK-01-03和感病青稞品种甘青2号为材料,以接种燕麦镰孢菌后抗感青稞茎基部为材料,利用Illumina HiSeq Xten平台对其转录组信息进行分析,通过对获得的转录本序列进行基因功能注释和分类。结果表明,受燕麦镰孢菌侵染后,抗感青稞的株高和根长度、植株鲜重和根鲜重均减少,且感病品种甘青2号株高和根长度、植株鲜重和根鲜重均低于抗病品种NQK-01-03。经过基因表达量注释,从抗感青稞品种的病健茎基部组织中共获得DEGs 29676个,其中上调基因16274个,下调基因13592个。使用BLAST软件与COG、GO、KEGG、KOG、NCBI-NR、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG数据库比对,28869条Unigene获得注释信息,其中NCBI-NR数据库中注释到的Unigene最多,达到28799条,占全部注释基因的99.76%。将DEGs与KEGG数据库进行比对,找到DEGs中显著性富集的代谢途径,共有28869个DEGs富集在240条代谢途径中,其中以Q-value≤0.05为阈值的代谢途径有21条。抗感青稞品种的病健茎基部组织差异表达基因KEGG参与的生理和信号传导方式有5类,分别参与代谢、合成、光合、加工和互作过程。抗感青稞品种的病健茎基部组织差异表达基因KEGG通路富集散点主要集中在苯丙基类生物合成、苯丙氨酸代谢、植物-病原互作、异喹啉类生物碱的生物合成、酪氨酸代谢、二萜类生物合成、谷胱甘肽代谢。抗感青稞品种的病健茎基部组织差异表达基因的KEGG通路富集主要有苯丙基类生物合成、苯丙氨酸代谢、淀粉与蔗糖代谢、酪氨酸代谢、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、氨基糖与核苷酸糖代谢6条。该结果在转录水平上初步明确了青稞与燕麦镰孢菌的分子互作机制。


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