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PEG胁迫下一氧化氮对紫花苜蓿幼苗内源激素及其microRNA调控机理的研究

张小芳  
【摘要】:紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一类优质的豆科牧草,其产量高,营养丰富,是世界上栽培历史悠久、种植面积最广泛的牧草作物,其根系粗壮,能够与根瘤菌共生,在改善生态环境和固氮培土方面发挥着重要的作用。但长期以来,对西北干旱和半干旱地区而言,缺水严重限制了紫花苜蓿的规模化种植,这与日益发展的农牧产业化体系不相适应,因此,增强紫花苜蓿的抗旱性对于推动西北地区产业化发展具有至关重要的作用。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是一种新型的气态信号分子,在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥着重要的作用。本试验以紫花苜蓿幼苗为材料,采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫,通过外源喷施一氧化氮释放剂硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP)和清除剂cPTIO(carboxy-PTIO),应用生理生化理论、small RNA测序技术和生物信息学方法,分析PEG胁迫下NO对紫花苜蓿叶片形态特征、4种内源激素(ABA,IAA,SA和GA_3)含量变化及miRNA调控的影响,研究PEG胁迫下NO对紫花苜蓿幼苗内源激素及其miRNA的调控机理。研究结果如下:(1)通过对紫花苜蓿叶片形态的分析表明,内源NO诱导气孔关闭的能力比外源NO更为显著,PEG胁迫下叶片的气孔长度和宽度减小,其气孔导度达到最小值;外源NO清除剂会使叶片的气孔长度和宽度增加,其气孔导度高于外源NO处理,表明苜蓿叶片中内源NO对气孔关闭有显著的促进作用。NO对提高叶片组织的抗旱性起着非常重要的作用,随胁迫时间的延长,外源施加NO会使叶片的海绵组织厚度增加,栅海比降低;当清除叶片中的NO,栅栏组织厚度增加,栅海比达到最大值,因此,NO在一定程度上可通过增加叶片组织的栅栏比来缓解干旱胁迫造成的损伤。(2)PEG胁迫下对紫花苜蓿叶片和根中4种内源激素的分析表明,NO可通过诱导紫花苜蓿中IAA、ABA、GA_3和SA四种激素的代谢水平及根中的相互转化调控植物的生长与抗逆性,尤其ABA和SA在叶片中的调节作用更为显著。1)PEG胁迫下外源喷施NO能促进叶片和根中NO含量的增加,其清除剂明显降低了叶片的NO含量;2)随着处理时间的延长,叶片和根中的ABA和SA含量逐渐增加,而根中ABA和SA含量的增加较晚于叶片。在胁迫第8 d,叶中外源NO处理的ABA含量比SA高6.68倍,而喷施NO清除剂的SA含量比ABA低77.22%,并且叶中外源NO处理的ABA含量明显高于根中;3)NO会在短期内诱导叶片和根中IAA和GA_3含量增加,在胁迫第4 d,叶片中外源NO处理的IAA含量高于其清除剂1.63倍;而叶片和根中的GA_3含量在第2 d达到最大值后逐渐降低。(3)miRNA的差异表达与分析结果显示:PEG胁迫下内源NO可通过富集更多与胁迫相关的生物学过程和分子功能来调控植物生长发育。在紫花苜蓿叶片的4个处理中共鉴定出91个已知miRNA和176个未知miRNA,它们分别来自47和61个miRNA家族;在PEG处理中鉴定了31个差异表达的miRNA,在干旱胁迫下大多上调表达;PEG+cPTIO处理共鉴定了12个差异表达的miRNA,它们大部分下调表达,其中,mtr-miR5213-5p在PEG+cPTIO处理中表达量最高并下调表达。对4个处理进行分析,从中筛选出15个共同表达的差异表达miRNA,对miRNA进行靶基因功能预测,GO富集和KEGG途径分析显示紫花苜蓿叶片中内源NO可参与氧化应激反应、激素和苯丙烷类代谢相关的生物过程及分子功能来响应干旱胁迫。转录组与miRNA的联合分析显示PEG胁迫下清除苜蓿叶片中NO会使部分miRNA下调表达。而miR2118上调表达并参与紫花苜蓿叶片内苯丙烷类的生物合成,c103018.graph_c0_2090的靶基因编码的F-box蛋自能够通过脱落酸(ABA)信号途径调控植物对干旱的耐受性;其中miR156家族起着至关重要的作用,可通过调节SPL基因增强植物胁迫耐受性;miR2199主要以BHLH转录因子行使功能,主要从气孔、叶毛与根毛的发育和对脱落酸的敏感性几方面参与植物耐旱应答。qRT-PCR定量结果证实miRNA表达和测序结果一致,并与其靶基因呈负调控的表达模式。


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