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QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立

丁耀忠  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原,猪是其唯一宿主。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,不分节段的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,根据抗原特性和基因组特征分为两个基因型:欧洲型(European,Eu),即1型PRRSV;北美型(North American,NA),即2型PRRSV。该病毒的基因组长度约为15 kb,具有九个或十个重叠的开放阅读框(ORF):ORF 1a-1b,ORF 2-7(病毒结构蛋白GP2,E,GP3,GP4,ORF5a,ORF5,M和N)。与马动脉炎病毒(equine arteritis virus,EAV),乳酸脱氢酶升高病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)和猴出血热病毒(simian hemorrhagic fever virus)为同一属病毒。我们分离了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV),将其命名为QH-08(Gen Bank:KU201579)。对其进行溯源后发现,其与HUN4和JXA1的进化变异几乎没有差异,全序列同源性分别为97.2%和97%,同时与HP/Thailand19500LL/2010(泰国,KF735060)、PRRSV/MZ/IND/1A/18(印度,MK287894)和BH58/10(老挝,JN626287)的全序列同源性为95.7%、93.8%和95.9%;遗传进化表明,这5株2型PRRSV分离株处在同一个进化分支上,而且QH-08分离株在进化谱系上与HUN4分离株具有更高的亲源性;同时在分子水平上比较34株分离株的同源性后得到了一种假想,即PRRSV-2型ORF1α1b的同源性差异是导致PRRS疫苗对于同源毒株攻毒保护力差异的重要原因,从而为疫苗选择和实时real-time RT-PCR的建立提供分子理论基础。对于天然抗病毒通路,如TLR 3凋亡途径,能否被有关刺激因子激活从而抑制PRRSV的感染能力;另外,选择一种可以防控QH-08 PRRSV的感染的疫苗对于将来促进PRRSV的防控可以提供一种参考依据;同时,由于PRRSV-2存在大量重组现象,建立能够覆盖经典毒株和变异毒株的、特异性检测PRRSV-2型的实时定量PCR技术,对于PRRSV-2型的防控具有积极意义。因此,在基于对不同的PRRSV-2型分子分析的基础上,进行了一些系列的研究。首先,通过病毒噬斑、qPCR和IFA等检测方法评估了刺激因子—盐酸吗啉胍对QH-08在Marc-145细胞上的复制有一定的抑制作用,其抑制机理是盐酸吗啉胍诱导在细胞水平上诱导TLR 3依赖的凋亡途径,进一步激活了caspas-8和caspas-3凋亡途径进而抑制了PRRSV复制,而且,这种抑制作用与caspase-3激活后Mcl-1表达量下调有关。这种通过激活caspase-8和caspase-3天然抗病毒信号通路或负调控Mcl-1表达来发挥其抗PRRSV的复制的机制,能够为天然抗病毒途径的研发提供启发作用。其次,选用了四种疫苗,分别为Ingelvac PRRS MLV、CH-1a、JXA1和JXA1-RMLV疫苗,其疫苗毒株的特性为ORF1α1b序列同源性为25.3-96.3%,而ORF2-ORF7同源性为85.8-99.6%。其中,第1组和第4组(n=5)的仔猪分别使用上述四种疫苗按照一一对应的方式分别进行免疫,第5组和第6组(n=3)仅仅注射PBS作为阳性和阴性对照。免疫28 d后,除阴性对照组外,第1组-第5组分别使用等量QH-08 PRRSV进行攻毒;与攻毒后14 d,将所有仔猪处死后进行尸检。研究表明,与第5组猪(阳性对照)相比,接种疫苗的猪的体温、肺损伤程度、血清和肺组织中的病毒含量水平显著降低(p0.05);在攻毒期内,JXA1和JXA1-R MLV疫苗对QH-08 PRRSV攻击提供了100%的保护,保护率显著的高于Ingelvac PRRS MLV和CH-1a疫苗的保护率。最后,基于QH-08分离株与其余毒株序列特性建立了一种检测2型PRRSV的实时定量PCR技术,研究表明,其检测最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性是多重RT-PCR的10倍;特异性良好,不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应性。对临床样品的阳性检出率和阴性检出率均为100%;研制的3批试剂盒在一定保存期内,其重复性、特异性和敏感性良好,可以满足2型PRRSV的临床检测和防控的需求。


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