收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于不同微球标记非洲猪瘟病毒和口蹄疫A型病毒免疫层析检测方法的建立

孙燕燕  
【摘要】:胶体金颗粒作为功能性载体材料与免疫层析检测技术结合形成的相关诊断方法及产品,具有操作简单、反应快速、特异性高和稳定性好等优点,已被广泛应用于医学检验、食品安全、兽药残留、环境监测等领域。但由于胶体金颗粒本身存在一些灵敏度的限制,目前仅用于定性检测。因此,对于免疫层析技术,突破难以定量分析的瓶颈,建立灵敏、特异、直观、快速的定量检测方法,才会更好的满足基层生产单位的现实需求,具有重大的技术改进价值和应用前景。因此,本论文建立了非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的免疫层析定性检测方法和口蹄疫A型病毒(FMDV-A)的免疫层析定量检测方法,具体研究内容如下:1.ASFV抗体胶体金定性免疫层析检测方法的建立。将重组ASFV p30蛋白(特异性和抗原性已验证)用胶体金颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线)组装试纸条。用该试纸条检测已知的ASFV阳性、阴性血清,检测可在5-10 min完成,灵敏度为1:256。平行检测口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等常见猪病毒病阳性血清20份,仅ASFV呈阳性反应,与其它血清无交叉,特异性可靠。用同一批次内、不同批次间的试纸条重复性检测ASFV阳性、阴性血清,结果差异不显著,变异系数CV均小于10%,稳定性良好。与进口ASFV竞争ELISA抗体检测试剂盒平行对比检测50份健康猪血清,试纸条检测出阴性结果48份,ELISA检测出阴性结果49份;平行对比检测52份ASFV抗体阳性猪血清,试纸条检出阳性50份,ELISA检出阳性51份。以ELISA方法为参照标准,试纸条的特异性为92.00%,敏感性为92.59%。2.FMDV-A抗体定量免疫层析检测方法的建立。1)抗原筛选。分别对5种备选抗原:纯化的AF/72和Re-A/WH/09毒株146S病毒颗粒及其原核表达VP1蛋白、及原核表达的A/GD/MM/13毒株VP1蛋白,用间接ELISA和胶体金免疫层析(GICA)平行检测100份背景清晰的FMDV-A、O、AsiaⅠ型田间样本血清,基于FMDV-A血清的阳性检出率计算其敏感性,基于对O、AsiaⅠ血清的交叉阳性计算其特异性。结果:AF/72-146S的敏感性和特异性在间接ELISA(90%,95%)和GICA(95%,92.5%)中均为最高,A/GD/MM/13-VP1最低(P/N为1.95)。Re-A/WH/09-146S ELISA(86.67%,87.5%)、GICA(83.33%,87.5%)、AF/72-VP1 ELISA(78.33%,75%)、GICA(90%,62.5%)、Re-A/WH/09-VP1 ELISA(76.67%,70%)、GICA(85%,55%)。AF/72-146S为最合适的诊断用抗原。2)FMDV-A抗体的免疫层析定量检测方法的建立。用抗坏血酸(AA)还原K_2Pt Cl_4和Na_2Pd Cl_4,经超声水浴法制备具有氧化还原酶活性的Pt-Pd合金纳米颗粒,作为捕获纳米标记物标记FMDV-AF/72-A-146S,与其抗体(FMDV-AF/72-146S-Ab)同时包被在NC上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线)组装试纸条。用该试纸条检测已知的FMDV阳性、阴性血清,检测可在10 min内完成,灵敏度为1:2~8。取已知液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体效价为1:64、1:128、1:256和1:512的口蹄疫A型阳性血清,用试纸条进行检测,完成后用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C值。以A型阳性血清样品的LPB-ELISA抗体效价为横坐标,金标分析仪读值T/C值为纵坐标作图,建立标准曲线。抗体效价与T/C比值之间呈良好的线性关系,相关系数R~2=0.9692。检测时将待检血清的T/C值带入标准曲线,即可对应获得该份血清的抗体效价。与胶体金试纸条平行比对检测50份FMDV-A血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条可检测出阳性结果49份,胶体金试纸条可检测出阳性结果48份,检测22份阴性血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条和胶体金试纸条均可检测出阴性结果22份,检测36份O、AsiaⅠ血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条可检测出阴性结果34份,胶体金试纸条可检测出阴性结果31份,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条的敏感性为98%,特异性为94.8%。用同一批次内、不同批次间的试纸条重复性检测不同抗体效价的FMDV-A阳性血清,结果差异不显著,变异系数CV均小于15%,稳定性良好。与LPB-ELISA平行检测102份背景清晰的血清样品,将二者抗体效价(Log10)进行比对,检测结果具有良好的一致性,相关系数R~2为0.9112。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前18条
1 智晓莹;任维维;祁光宇;吕建亮;梁仲;蒋韬;;O型口蹄疫抗体金标检测试纸条判定标准的确立[J];畜牧兽医学报;2012年09期
2 孙燕燕;马米玲;周广青;林密;曾巧英;蒋韬;;A型口蹄疫病毒抗体金标检测试纸条的研制[J];中国兽医科学;2016年09期
3 莫丽娜;肖开鹏;张运;吴殿军;;口蹄疫的防控[J];现代农业科技;2009年16期
4 肖旭倩;胡正龙;沈文涛;言普;周鹏;;利用转基因植物生产口蹄疫可饲疫苗研究进展[J];广东农业科学;2009年06期
5 周向梅;赵德明;孙艳明;杨建民;马李颖;;一步法RT-PCR快速检测口蹄疫O型病毒[J];中国兽医杂志;2007年01期
6 班磊;张婷;;基于酶-纳米颗粒试纸条可视化检测致病菌的研究[J];中国饲料;2019年21期
7 张琨;王伟华;万一;颜真;訾静;王军;高磊;;基于顺磁微粒的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫层析试纸条的制备[J];西北大学学报(自然科学版);2016年03期
8 闫海滨;赵刚;朱江巍;申绍庆;;口蹄疫诊断技术的研究进展[J];现代畜牧兽医;2010年04期
9 左庭婷,端青,姜永强,郑玉玲,檀华,李晓萸,王晓伟;A型肉毒毒素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制[J];军事医学科学院院刊;2003年06期
10 李敏杰;许智强;刘彦玲;周国辉;于力;;A型口蹄疫抗体固相竞争ELISA检测方法的建立[J];中国预防兽医学报;2020年09期
11 何随彬;金盈宇;龚志亮;金耀忠;姜法铭;曹杰;叶承荣;;口蹄疫疫苗最新研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2019年02期
12 陈焕永;陈晓红;;口蹄疫的诊治进展[J];中国实用内科杂志;2006年20期
13 董菡;张倩瑶;成玉梁;于航;谢云飞;姚卫蓉;郭亚辉;钱和;;乳制品抗生素快检试纸条的研究进展[J];中国乳业;2020年08期
14 黄云飞;何宝祥;;温度对乳酮检测试纸条性能的影响[J];广西畜牧兽医;2014年02期
15 高博;;“瘦肉精”快速检测试纸条的使用方法[J];畜牧兽医科技信息;2014年03期
16 万宇平;唐承明;罗晓琴;冯才伟;崔艳莉;;β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条的质量测试研究[J];四川畜牧兽医;2013年02期
17 杨沁;林彤;高闪电;常惠芸;;口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及应用研究进展[J];生物技术通讯;2012年03期
18 袁铁琰,张大兵,王全喜;试纸条技术在转基因农作物检测中的应用[J];生物技术通报;2004年05期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 程凯慧;王洪梅;何洪彬;;我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2015年
2 泰鹏;谢雪岑;孙艳琪;;一种简便的澄清口蹄疫病毒悬液的方法[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
3 王子龙;李游;曾志将;吴小波;;中华蜜蜂囊状幼虫病病毒胶体金快速检测试纸条的研制[A];二十一世纪第二届全国蜂业科技与蜂产业发展大会论文集摘要[C];2016年
4 黄娇玲;谢芝勋;谢志勤;刘加波;谢丽基;庞耀珊;邓显文;范晴;罗思思;张艳芳;曾婷婷;王盛;;基于Au/Fe_3O_4免疫层析试纸条快速检测H7亚型AIV的研究[A];中国畜牧兽医学会2016年学术年会、中国畜牧兽医学会禽病学分会第十八次学术研讨会论文集[C];2016年
5 杨晓炼;常迪;侯晓林;;利巴韦林快速检测试纸条的初探[A];第八届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2016年
6 蒲晓允;幕之勇;;快速检测蔬菜变质试纸条的研究[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年
7 马金玲;常惠芸;王雯慧;陈怀涛;;口蹄疫持续感染机制概述[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年
8 王继;常枨;杨路达;宣超莹;袁为林;段景龙;王燕;张莎莎;李丽敏;王家鑫;;O型口蹄疫病毒样颗粒的制备与鉴定[A];中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集[C];2016年
9 彭伏虎;胡思顺;王政;刘梅;毕丁仁;王喜亮;肖运才;许清荣;;通用型禽流感病毒胶体金快速检测试纸条的研制与应用研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
10 徐诺;蔡齐勇;李朝辉;冶保献;;基于量子点及试纸条技术对破伤风抗体进行快速灵敏测定的研究[A];河南省化学会2014年学术年会论文摘要集[C];2014年
11 高明春;张润祥;曹永生;王君伟;;口蹄疫3B表位串联肽ELISA鉴别诊断疫苗免疫和自然感染牛[A];中国奶业协会第26次繁殖学术年会暨国家肉牛牦牛/奶牛产业技术体系第3届全国牛病防治学术研讨会论文集[C];2011年
12 郭慧琛;刘在新;孙世琪;云涛;冷青文;马军武;刘湘涛;谢庆阁;;口蹄疫DNA疫苗对豚鼠的免疫效果研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
13 李莉;逄大欣;任林柱;张莉影;李占军;欧阳红生;;抗人血白蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制[A];全国动物生理生化第九次学术交流会论文摘要汇编[C];2006年
14 孙亚云;倪修文;李建华;;HBsAg/TP联合试纸条应用于献血前筛查效果评价[A];中国输血协会第九届输血大会论文专辑[C];2018年
15 张成福;张子玉;;PAN试纸条的制取及精斑检测[A];首届中国法医物证学术交流会论文汇编[C];1993年
16 彭贵青;陈焕春;钱平;;口蹄疫诊断方法最新研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
17 鲁会军;韩松;金宁一;;口蹄疫诊断方法研究进展[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
18 刘大贵;罗先惠;;口蹄疫的检验与防控[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集[C];2007年
19 童晓辉;;日本消灭口蹄疫做法简介[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
20 胡慈斌;;日本扑灭口蹄疫及其启示[A];福建省科协第四届学术年会卫星会议“动物疫病防治与人类健康”学术年会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 孙燕燕;基于不同微球标记非洲猪瘟病毒和口蹄疫A型病毒免疫层析检测方法的建立[D];甘肃农业大学;2021年
2 王开宇;口蹄疫基因工程疫苗免疫效果的评价与机制研究[D];第二军医大学;2008年
3 何雁南;口蹄疫新型疫苗研究[D];华中农业大学;2008年
4 曾海娟;瓜类细菌性果斑病菌单克隆抗体的制备及免疫层析快速检测方法的建立[D];上海理工大学;2018年
5 陈豪泰;口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究[D];甘肃农业大学;2012年
6 陈关平;O型口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2008年
7 李斌;金属纳米粒子的功能化及抗肿瘤研究[D];南京大学;2019年
8 孙海南;金纳米颗粒的表面性质调控细胞氧化应激的研究[D];山东大学;2018年
9 王守巨;金纳米颗粒介导的肿瘤光复合治疗[D];南京大学;2013年
10 程侠菊;光触发金纳米颗粒聚集在肿瘤诊疗中的应用研究[D];苏州大学;2018年
11 马军;单颗粒暗场光散射成像:灵敏度、准确度提升及多靶物分析应用研究[D];西南大学;2017年
12 Nouredine BEHLOUL(艾丁);戊型肝炎-口蹄疫嵌合疫苗的设计和基础研究[D];东南大学;2018年
13 刘会胜;口蹄疫病毒拮抗宿主NOD2介导的抗病毒作用研究[D];甘肃农业大学;2018年
14 张天亮;p53对口蹄疫病毒复制及致病性的影响[D];甘肃农业大学;2018年
15 解银丽;O型口蹄疫病毒非结构蛋白3B影响宿主天然免疫的机理[D];西北农林科技大学;2019年
16 刘畅;截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析[D];吉林大学;2019年
17 韩玲玲;口蹄疫病毒持续感染建立的分子机制探索[D];武汉大学;2018年
18 王燕琴;马甲状腺上皮细胞抗FMDV感染机制研究[D];西北农林科技大学;2016年
19 马鸣潇;FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究[D];吉林大学;2007年
20 杨苏珍;猪O型口蹄疫抗体免疫层析试纸的研制及应用[D];河南农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 程珍珠;检测伪狂犬病毒抗体及病原的免疫层析试纸条的研制[D];华南农业大学;2018年
2 胡卫国;A亚群禽白血病病毒(ALV-A)胶体金检测试纸条的研制[D];山东农业大学;2019年
3 梁国智;NDRV可视化RT-LAMP及其核酸试纸条检测方法建立与初步应用[D];佛山科学技术学院;2017年
4 李书剑;禽网状内皮组织增生症病毒抗原快速检测试纸条的研制及应用[D];扬州大学;2019年
5 聂阿秀;催化发卡自组装信号放大试纸条传感器用于癌症标志物快速检测[D];华中农业大学;2019年
6 邵艳娜;荧光免疫层析试纸条定量检测肌酸激酶同工酶和真菌毒素[D];南昌大学;2019年
7 应昊骏;时间分辨免疫试纸条快速检测真菌毒素和IL-6的实验研究[D];中国人民解放军陆军军医大学;2019年
8 刘娟祖;量子点荧光试纸条的构建及其在生物分子检测中的应用研究[D];郑州大学;2019年
9 康加祥;α-防御素荧光试纸条的研制及在人工关节感染诊断的初步应用[D];福建医科大学;2018年
10 田美玲;免疫层析试纸条新型信号放大策略的构建与性能研究[D];西南大学;2019年
11 陈旭阳;快速定量检测HCG、cTnI的磁性免疫层析试纸条的研制[D];南方医科大学;2018年
12 张小波;旋毛虫病荧光免疫层析抗体检测试纸条的建立[D];吉林大学;2018年
13 王雪伟;牛传染性鼻气管炎抗体胶体金免疫层析方法的建立[D];河北农业大学;2018年
14 刘越;双酚A和邻苯二甲酸二甲酯荧光检测试纸条的研制[D];天津科技大学;2018年
15 初芳宇;阿特拉津量子点标记免疫层析试纸条的研制[D];天津科技大学;2018年
16 曹雪莉;两种海洋弧菌快速检测试纸条的研制及应用[D];集美大学;2016年
17 张琳琳;传染性胰腺坏死病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[D];东北农业大学;2014年
18 赖晓虹;CK-MB时间分辨荧光免疫层析试纸条的研制[D];广州中医药大学;2016年
19 赵巍;J亚群禽白血病病毒抗体快速检测试纸条的研制[D];扬州大学;2018年
20 韩阳瑞;弓形虫循环抗原表达及镧系微球免疫层析试纸条的研制[D];中国农业科学院;2018年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 本报记者 姜凝;小小试纸条帮果农增产增收[N];天津日报;2020年
2 张永光 研究员;全球口蹄疫疫情警报声声急[N];中国畜牧报;2004年
3 农垦科学院畜牧兽医研究所高级兽医师 桑学波;春季家畜口蹄疫的防控措施[N];北大荒日报;2020年
4 州动物疫病预防控制中心;世界动物卫生组织到德宏评估口蹄疫防控情况[N];德宏团结报;2018年
5 李新生 林甘;世界口蹄疫风云评说[N];广东科技报;2001年
6 本报驻韩国记者 莽九晨;韩国全力应对最大规模口蹄疫[N];人民日报;2010年
7 陕西省富平县刘集中学 刘清雅;关于“口蹄疫”“疯牛病”[N];学知报;2011年
8 周琦 曲连东;充分重视口蹄疫的预防[N];山西科技报;2001年
9 本报记者 李鹏;大兴口蹄疫源头未明[N];北京科技报;2010年
10 驻日本使馆经商处 初月;口蹄疫殃及日本部分肉类产品出口[N];国际商报;2010年
11 本报记者 王城;日韩爆发口蹄疫为我们带来的警示[N];中国食品报;2010年
12 记者 蓝建中 何德功;日本设立“口蹄疫对策本部”[N];经济参考报;2010年
13 驻东京记者 刘洪亮;日本全力应对口蹄疫[N];文汇报;2010年
14 记者 何德功;日本“超级种牛”感染口蹄疫[N];新华每日电讯;2010年
15 何德功;日本出台《口蹄疫对策特别措施法》[N];中国食品质量报;2010年
16 龙新;农业部发布2起猪O型口蹄疫疫情[N];农民日报;2010年
17 记者 班威;韩口蹄疫疫情蔓延[N];新华每日电讯;2010年
18 陈越;口蹄疫使南非经济蒙受重大损失[N];中国贸易报;2000年
19 赛娜;中国大规模暴发口蹄疫缺乏诱困[N];中国畜牧兽医报;2005年
20 王亚光朱绍斌;我国有效控制口蹄疫暴发流行[N];中国畜牧兽医报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978