马铃薯花粉原生质体的分离与培养

【摘要】： 花粉原生质体兼具单倍体与原生质体的双重优点，可直接作为产生单倍体植 株和细胞融合的原始材料，省去降倍操作，在马铃薯细胞工程育种中具有重要意 义。 本研究以6个优良四倍体栽培种和3个双单倍体的不同发育时期的花粉为供体 材料，对花粉原生质体分离与培养的技术进行了研究。在蔗糖作为渗透压调节剂， 蜗牛酶浓度为1.2％的混合酶液中，四分体原生质体的分离率最高达84.6％。低温处 理7天后的花粉为材料，分离原生质体，在分别添加100mg/L的丝氨酸、800mg/L的 谷氨酰胺和0.1％的小牛血清以及1mg/L 2，4-D，0.5mg/L KT，0.4mg/L 6-BA外源激 素的K_3培养液中，培养24h后，原生质体再生细胞壁，48h右，再生细胞启动第一 次分裂，分裂频率最高达15.4％。继续培养15d左右，部分细胞增殖生成细胞团。 用花药漂浮培养法作为酶解前的预处理，将从花药释放培养1d后的花粉酶 解，在0.8mol/L的甘露醇作渗透压调节剂的混合酶液中，单核期幼嫩花粉原生质体 的分离率达12.8％。 对马铃薯花粉离体萌发的影响因素进行了研究，萌发液中添加0.1mmol/L K~+， 1.0mmol/LMg~(2+)对花粉萌发率有显著促进作用；添加0.15mmol/L的Na~+能加快萌发速 度，但对提高萌发率无效。在10％蔗糖，0.02％ CaCl_2，0.02％H_3BO_3， 0.02％MgSO_4·7H_2O，0.01％KNO_3的液体培养基上，花粉萌发率达70％以上。 建立了“低温-萌发-酶解”马铃薯成熟花粉原生质体分离技术路线。用低温处 理7d的花粉，萌发30min时加入酶液，以1.2mol/L的甘露醇作渗透压调节剂，原 生质体的分离率最高达21.04％。萌发时间大于120min，花粉原生质体的分离率下 降为16.05％，而亚原生质体的分离率为5.35％。对花粉原生质体与花粉管亚原生质 体的培养中发现成熟花粉诱导脱分化困难；花粉管亚原生质体有很强的细胞壁再生 能力和自体融合倾向。 对超低温保存花粉的冻存、复苏方式以及复苏后花粉的生活力进行了研究， 并分离花粉原生质体。在冷冻前，18h的干燥时间保存花粉的生活力优于干燥12h和 6h的花粉；超低温保存的花粉在-20℃－4℃－25℃的水浴锅里逐步解冻效果最好，快 速化冻方式对马铃薯花粉也适宜，35℃的解冻温度优于25℃；用ZF萌发液将花粉先 萌发，再用分离新鲜花粉原生质体的酶液和技术将花粉酶解，保存90d的花粉，原 生质体分离率为16.21％。尽管保存花粉的生活力较新鲜花粉生活力有所下降，但经 解冻复苏后仍能作为原生质体分离的材料，与新鲜花粉原生质体的分离率差异不显 著。 本研究对马铃薯花粉原生质体进行了较为详细的研究，建立了不同发育时期 甘肃农业大学硕士论文 马铃薯花涵原生质体的分离与培养 中文摘要 一 花粉原生质体分离的技术路线，并进行了培养研究，结果证实所建立的技术路线具 有普遍适应性。