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马铃薯花粉原生质体的分离与培养

张峰  
【摘要】: 花粉原生质体兼具单倍体与原生质体的双重优点,可直接作为产生单倍体植 株和细胞融合的原始材料,省去降倍操作,在马铃薯细胞工程育种中具有重要意 义。 本研究以6个优良四倍体栽培种和3个双单倍体的不同发育时期的花粉为供体 材料,对花粉原生质体分离与培养的技术进行了研究。在蔗糖作为渗透压调节剂, 蜗牛酶浓度为1.2%的混合酶液中,四分体原生质体的分离率最高达84.6%。低温处 理7天后的花粉为材料,分离原生质体,在分别添加100mg/L的丝氨酸、800mg/L的 谷氨酰胺和0.1%的小牛血清以及1mg/L 2,4-D,0.5mg/L KT,0.4mg/L 6-BA外源激 素的K_3培养液中,培养24h后,原生质体再生细胞壁,48h右,再生细胞启动第一 次分裂,分裂频率最高达15.4%。继续培养15d左右,部分细胞增殖生成细胞团。 用花药漂浮培养法作为酶解前的预处理,将从花药释放培养1d后的花粉酶 解,在0.8mol/L的甘露醇作渗透压调节剂的混合酶液中,单核期幼嫩花粉原生质体 的分离率达12.8%。 对马铃薯花粉离体萌发的影响因素进行了研究,萌发液中添加0.1mmol/L K~+, 1.0mmol/LMg~(2+)对花粉萌发率有显著促进作用;添加0.15mmol/L的Na~+能加快萌发速 度,但对提高萌发率无效。在10%蔗糖,0.02% CaCl_2,0.02%H_3BO_3, 0.02%MgSO_4·7H_2O,0.01%KNO_3的液体培养基上,花粉萌发率达70%以上。 建立了“低温-萌发-酶解”马铃薯成熟花粉原生质体分离技术路线。用低温处 理7d的花粉,萌发30min时加入酶液,以1.2mol/L的甘露醇作渗透压调节剂,原 生质体的分离率最高达21.04%。萌发时间大于120min,花粉原生质体的分离率下 降为16.05%,而亚原生质体的分离率为5.35%。对花粉原生质体与花粉管亚原生质 体的培养中发现成熟花粉诱导脱分化困难;花粉管亚原生质体有很强的细胞壁再生 能力和自体融合倾向。 对超低温保存花粉的冻存、复苏方式以及复苏后花粉的生活力进行了研究, 并分离花粉原生质体。在冷冻前,18h的干燥时间保存花粉的生活力优于干燥12h和 6h的花粉;超低温保存的花粉在-20℃-4℃-25℃的水浴锅里逐步解冻效果最好,快 速化冻方式对马铃薯花粉也适宜,35℃的解冻温度优于25℃;用ZF萌发液将花粉先 萌发,再用分离新鲜花粉原生质体的酶液和技术将花粉酶解,保存90d的花粉,原 生质体分离率为16.21%。尽管保存花粉的生活力较新鲜花粉生活力有所下降,但经 解冻复苏后仍能作为原生质体分离的材料,与新鲜花粉原生质体的分离率差异不显 著。 本研究对马铃薯花粉原生质体进行了较为详细的研究,建立了不同发育时期 甘肃农业大学硕士论文 马铃薯花涵原生质体的分离与培养 中文摘要 一 花粉原生质体分离的技术路线,并进行了培养研究,结果证实所建立的技术路线具 有普遍适应性。


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