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农杆菌介导的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化黄瓜的方法研究

杨成德  
【摘要】: 本实验在国内首次用几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因对黄瓜进行了转 化。供试黄瓜品种为津研4号和长春密刺等。供试菌株LBA4404含有质粒pCG Ⅱ,为几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的双价表达载体,此两种酶是经过 修饰(去掉胞内表达的信号肽)表达于细胞间隙的酶。本实验主要对黄瓜子 叶、下胚轴的再生和转化系统进行优化的研究,探索用农杆菌介导的几丁质 酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化黄瓜的最佳方法。 再生系统的优化研究表明:两个品种的子叶为最佳外植体,其再生潜力 优于下胚轴。其最佳诱导培养基为:MS_1(MS+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L)、 MS_2(MS+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L)、MS_8(MS+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L);分化培养基为:MS_9(MS+NAA 0.1mg/L+KT 1.0mg/L)、MS_(10) (MS+NAA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L)。生根培养基为A3(1/2 MS)。 本实验优化的转化系统为:外植体以3日苗龄最佳;农杆菌浓度的OD_(600) 值为0.6(约10~8cells/ml);乙酰丁香酮浓度以40~50μmol/L最适;下胚轴、 子叶分别预培养36、24小时转化率最高;下胚轴、子叶分别侵染10、15分 钟最佳;长春密刺下胚轴、子叶和津研4号下肢轴、子叶的共培养时间分别 为3、4和4、5天。愈伤组织诱导、分化和生根过程中以75mg/L卡那霉素 (Kan)为选择压。 用几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因通过农杆菌介导转化黄瓜,津研4号 和长春密刺都获得了抗卡那霉素(Kan~R)转化植株。对转化植株进行冠瘿碱 检测表明Kan~R转化植株冠瘿碱呈阳性。经初步测定,转化植株对黄瓜枯萎 病菌(Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum Owen)有较强的抗性。 本实验在国内首次获得通过农杆菌介导几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因 转化黄瓜的抗性(Kan~R)植株。


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