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幽门螺杆菌尿素酶的纯化及其单克隆抗体的研制

李有全  
【摘要】: 接种幽门螺杆菌NCTC11637于5%马血HP肉汤,37℃微需氧摇振培 养72h以上,离心收集培养上清,并以0.45μm滤膜过滤,用50%饱和硫 酸铵沉淀粗提尿素酶,再用离子交换层析柱Source Q15纯化,经SDS—PAGE 分析证实幽门螺杆菌纯化尿素酶由Uea A(29.5 Ku)和Urea B(65 Ku)两亚单 位组成。 用粗提幽门螺杆菌尿素酶(加佐剂)腹腔免疫雌性Balb/c小鼠,取免 疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在融合剂聚乙二醇(PEG,MW4000) 作用下融合,筛选并建立幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体(McAb D53)杂交 瘤细胞株(HPUD53)。经鉴定,杂交瘤HPUD53具有以下特征:①杂交 瘤HPUD53连续传代120d,抗体分泌稳定;②染色体数目较多(100±5 条),较集中,比较理想。幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体McAb D53的特征: ①McAb D53属IgG类和IgG2a亚类;②McAb D53特异性强,与大肠 杆菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、空肠弯曲菌无抗体交叉反 应;③抗体效价高,培养上清和腹水抗体效价均为1:10~6;④Western Blot 分析,McAb D53为幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(Urea B)单克隆抗体。 以待测检样(抗原)包被酶标板,以幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体(McAb D53)为已知抗体,碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig(G,A,M)为显色抗体,建立 检测尿素酶间接EtnA法。该法特异性强,敏感性高,对尿素酶的最小检 出量为 0.2 gb,对幽门螺杆菌整菌最小检出量约为 4 XI炉 SellS/nil。该结 果表明,McAb D53对尿素酶(可溶性抗原)的检测具有高度敏感性,而对 幽门螺杆菌全菌的检测具有一定的局限性。


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