几种牧草和草坪草植物遗传转化体系的建立及其转基因研究

【摘要】： 本文研究了多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、百脉根(Lotus corniculatus L.)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)、中华结缕草(Zoysia sinica Steud.)、草地早熟禾(Poa pratensis L.)等五种禾本科草和豆科草的组织培养及其植株再生，建立了黑麦草和结缕草的遗传转化体系；同时，对百脉根和紫花苜蓿进行了转基因研究。 1．禾本科草遗传转化体系的建立和外源基因转化的研究 利用基因工程培育和改良禾本科牧草与草坪草品种是一种便捷和实用的途径。由于禾本科植物自身的特点，它们的组织培养和再生体系的建立和完善较为困难，而禾本科草的转基因操作和应用研究难度更大。本文对黑麦草、结缕草及早熟禾进行组织培养和植株再生研究，建立了黑麦草和结缕草的基因枪遗传转化体系，为其转基因操作奠定了良好的基础；并将外源基因导入黑麦草和结缕草，以提高其在干旱、低温、病害等不良环境中的生存能力。 从大麦基因组中克隆了胭脂碱合成酶NASHOR1基因，构建了pBNAS表达载体，用于后期转基因研究。 建立了黑麦草胚性愈伤组织诱导和再生体系。研究结果表明：不同品种的愈伤组织诱导率不同，其中春潮的愈伤诱导频率最高；最适的基本培养基是MS培养基，春潮在MS培养基上愈伤诱导率为21.95％；黑麦草愈伤组织诱导的最适2，4—D浓度是5mg/L；在愈伤诱导和继代培养基中添加0.05mg/L6-BAP和2mg/L ABA及一定量的水解酪蛋白，有利于改善愈伤组织的质量，提高愈伤的分化率；继代培养时间对愈伤组织的分化率有很大影响；植物凝胶(phytage1)与国产琼脂相比固化效果更好。 建立了黑麦草抗性愈伤组织的筛选方案。较好的筛选剂是G418，筛选浓度为50mg/L和75mg/L的筛选效果分别达10.31％和6.5％，筛选时间40—60天为宜。 建立了黑麦草愈伤组织基因枪转化体系。其技术要点为：选用继代培养 60－90天的胚性愈伤组织作为转化受体，采用1100psi的压力、每枪250％ 金粉和… gDNA的用量、6cm的轰击距离和每皿材料轰击二次的转化参数，可 获得较好的转化效果。愈伤组织受体在轰击前12小时至轰击后24小时期间 用90mg／L的甘露醇进行高渗处理，可明显的提高转化效率。 获得了转基因黑麦草。应用本研究建立的基因枪转化体系，将促进植物 铁吸收和运输的大麦胭脂碱合成酶NASHORI、提高植物抗冻能力的拟南芥转 录因子CBFI、增加植物抗病性的T4溶菌酶LYS基因分别导入黑麦草的胚性 愈伤组织，获得PCR检测阳性的植株数为20、12和9株。对部分植株进行了’ 点杂交、Southe，n杂交等分子检测，结果表明外源基因己整合到黑麦草基因 组中。＼ASHORI转基因植株田间干旱试验的结果证实外源基因表达，增强了 黑麦草体内铁载体的功能，叶绿素含量升高，明显提高了植株的抗旱能力； 对CBFI、LYS基因的田间检测正在进行。 此外，进行了结缕草和早熟禾的愈伤组织诱导和再生的研究，获得组织 再生苗。同时，建立结缕草愈伤组织基因枪转化体系，导入CBFI基因，获得 具有筛选剂抗性的转基因结缕草。 2．豆科草百脉根和首蒂的转基因研究 很多豆科植物不仅是人类自身蛋白质和脂肪的重要来源之一，也是牲畜 的优良饲料，还在土壤改良、水土保持以及生态环境保护方面发挥着积极作 用。其中，盲猜营养丰富，蛋白含量占干物质的 17－20％，百脉根不易引起家 畜的膨胀病，其利用价值较高。传统育种方法培育和改良豆科牧草品种所需 周期较长、过程繁琐。利用基因工程技术改良豆科牧草，避兔了这些不利因 素，缩短育种周期、打破物种界限，更为便利和快捷。本研究将增加植物茎 生长的拟南芥GA20－氧化酶基因、促进植物铁吸收和运输的大麦胭脂碱合成 酶＼ASHORI基因导入百脉根和首淆，提高其主物学产量和抗逆性，以增加牧 草植物的生态适应范围。 本研究优化了百脉根农杆菌叶盘转化法，以农杆菌AGLI菌株、子叶转化 受体、三天共培养时期为最佳转化条件，卡那霉素对百脉根适宜的筛选浓度 是25m矿，头泡霉素对农杆菌AGLI菌株的抑制作用比替卞霉素强。 以豆科植物百脉根Leo和＊子叶为转化受体，采用根癌农杆菌介导方法 将GA20－氧化酶基因导入，得到了转基因百脉根，PCR检测、点杂交、Southern 杂交方法均证明外源目的基因己整合到百脉根基因组中。田间测试到转基因 百脉根植株比对照植株的生物学干重增加了1．44％；转基因植株叶片叶色比 对照植株的浅，叶绿素含量比对照的低，可能是GA20－氧化酶基因表达，促 进植物细胞分裂和细胞伸长的结果。通常百脉根转化体在筛选培养基上不易 生根，但在本实验中，子叶转化体在筛选培养过程中己经生根：在田间试验 中还发现百脉根转基因植株的根部没有了豆科植物特有的根瘤结构，推测这 些现象与外源GA20－氧化酶基因的转入有关。 ． 将＼ASHORI基因导入百脉根Leo和＊的子叶和胚轴转化体，获得的转基 因植株经PCR检测、点杂交、SO。them杂交检测，证实了外源基因在百脉根 基