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口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达

吴雨霞  
【摘要】: 口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物传染病,严重危害家畜的生产力和畜产品质量,给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失,直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生,因而受到人们的普遍关注。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白VP1-4各60个拷贝组成,VP1蛋白又称1D蛋白,其基因位于基因组的2977-3615,编码213个氨基酸。早期研究表明,结构蛋白VP1暴露在病毒颗粒的表面,是诱导产生中和抗体的主要成分。 本试验以保存的pGEM-VP1质粒为模板,用特异性表达引物PCR扩增得到口蹄疫病毒(FMDV)VP1目的基因(639bp),对目的基因和穿梭表达载体pTriEx分别以相同的限制性酶NcolⅠ和XholⅠ消化后,经连接酶连接构建成重组表达载体,转化宿主菌BL21(DE_3)pLySs后得到重组质粒pTriEx—VP1,通过酶切及PCR扩增鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因正确插入到表达载体。随后用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS—PAGE电泳、Western-blotting分析检测,结果表明结构蛋白VP1基因在大肠杆菌中能高效表达,表达量占菌体蛋白总量的26%以上,表达的目的蛋白的分子量约为26kD。该表达产物为融合蛋白,能被口蹄疫阳性血清所识别。进一步的试验证明表达产物为可溶性的蛋白,此蛋白不需要进行变性、复性的纯化处理,用ProBond~(TM) Column进行亲和层析得到初步纯化的VP1蛋白,经ELISA检测此蛋白有活性。将穿梭重组质粒pTriEx—VP1转染BHK21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,重组质粒pTriEx—VP1能在BHK21细胞中表达,但表达量较低。本试验为进一步研究VP1的晶体结构、建立口蹄疫的诊断方法提供了材料。


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