用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建

【摘要】： 马铃薯(Solanum tuberosum L．)是世界上唯一的粮菜兼用型作物，在人们的日常生活和国民经济中起着举足轻重的作用。马铃薯淀粉由于其优良的加工性能，应用范围极其广泛，而且在某些应用领域是其它来源的淀粉所无法替代的。在西部大开发的历史机遇下，马铃薯生产和加工将成为西部农村经济的支柱产业，但现有的主栽马铃薯品种淀粉含量一般在13～18％，仅有少数品种可达到20％左右。为适应马铃薯加工产业的迅速发展，选育适合甘肃栽培的高淀粉含量马铃薯加工型品种的工作迫在眉睫。由于高淀粉含量的马铃薯育种材料极其匮乏，加之马铃薯又是同源四倍体，遗传分离复杂，故运用常规育种方法培育高淀粉含量的马铃薯品种不仅耗时耗能且难度极大。基因工程技术则可以打破物种间的界限，使得不同生物来源的基因在受体植株的特定时空表达，近年来随着人们对淀粉生物合成途径及其相关酶的进一步深入研究及分子生物技术的日趋成熟，使得运用基因工程技术调控淀粉合成中相关酶的活性从而提高马铃薯块茎淀粉含量成为可能。 本研究从马铃薯组培苗(台湾红皮)叶片中提取基因组DNA，设计PCR扩增特异引物，克隆到马铃薯块茎特异性表达启动子Class Ⅰ Patatin的功能区段，将其与pUCm-T easy vector连接，转化E.coli DH5α，得到重组子pUCmP；经酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1030bp，通过序列对比分析发现与已报道的Class Ⅰ Patatin碱基序列有94％的同源性，含有TATA box与CAAT box调控元件，分别位于转录起始点上游-21～-13bp与-59～-48bp；CAAT box上游有核心增强子(core enhancer)同源序列TGGTTATG。从大肠杆菌BL21中提取细菌基因组DNA，设计特异扩增引物，采用PCR扩增技术克隆到大肠杆菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(glgC)基因，将其与pUCm-T easy Vector连接，转化E.coli DH5α，得到重组子pUCmG；经酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1296bp，编码432个氨基酸残基，通过序列分析与文献报道的碱基序列有99％的同源性。考虑到变构调节因子对腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的调控作用，设计突变引物，采用PCR重叠延伸技术，用三轮对向扩增的方法对glgC基因进行第1007位核苷酸由G到A的定点突变，即使第336位氨基酸由甘氨酸变为天门冬氨酸，以降低该酶对激活因子果糖—6—磷酸(F6P)的依赖性和对抑制因子腺苷—1—磷酸(AMP)的敏感性，得到正确的突变基因glgC336及其转化子pUCmGT。 然后将glgC和91gC336基因分别插入到微生物表达载体pET一28a一c(+)的T7 启动子和终止子之间，构建成N一端携带6xHis标签子的原核表达载体，通过冲TG 诱导表达，提取表达产物，进行SDS一PAGE电泳鉴定，都得到分子质量约53 xlo几 的特异蛋白条带，证明glgC和91gC336基因的表达产物分子质量与理论推算g馆C 的分子质量相符。 最后分步将Pa、atin启动子、glgC和91gC336插入pB工101质粒，使glgC和 91gC336在Patatin启动子驱动之下，构建成植物表达载体pB工PG和pB工PGT，为 进一步做转化和选育高淀粉马铃薯品种奠定了基础。