EGFP标记胚胎干细胞体外向心肌样细胞分化及拟胚体形成的初步研究

【摘要】：胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)是从植入前的小鼠胚胎内细胞团 (Inner mass cells, ICM)或原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）分离和克 隆的多能性细胞，具有自我更新能力，在体内和体外能够发育分化成来自三胚层 的前体祖细胞。ES 细胞作为体外理想的细胞模型，可以研究真核细胞在早期胚 胎发育时期基因的表达和调控；也为未来的再生医学带来了希望。小鼠胚胎干细 胞已广泛应用于基因突变分析或结合标记基因的研究中。分子标记在研究细胞分 化中的基因表达和跟踪筛选分化细胞亚群的研究中有很好的应用价值。利用小鼠 胚胎干细胞在体外可以研究人们感兴趣的基因，但更重要的是可以制作嵌合体在 体内分析胚胎发育过程中基因的表达。绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 不依赖于任何底物就可以发出荧光，活细胞可以直接在荧光显微镜下以 488nm 波长激发光下检测绿色荧光，把 GFP 基因转入胚胎干细胞内，使胚胎干 细胞携带 GFP 基因并表达绿色荧光蛋白，最终使胚胎干细胞无论在体外或体内 的分化轨迹都可通过直接检测激发绿色荧光蛋白发出的荧光而得到监测和跟踪。 已有一些其他的 GFP 转染的 ESC 通过电转或其他的方法建立。本研究用磷酸钙 共沉淀法将质粒 pEGFP－N2 导入小鼠胚胎干细胞 D3 细胞系中，在荧光显微镜 下以 488nm 激发光检查阳性克隆，并进行初步扩增。经 G418 筛选后，机械挑取 EGFP 强阳性表达的克隆，并在丝裂霉素 C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层 上进一步扩大培养，获得纯化的转染细胞系。20 代以后，转染细胞仍然表达绿 色荧光蛋白。PCR 检测和序列分析表明 8 代和 18 代转染细胞均携带有 GFP 标志 基因。对稳定表达 EGFP 的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚体和畸胎瘤形成 的检测，证明这些细胞具有干细胞的特征。经拟胚体，可进一步分化成具有搏动 能力的心肌细胞，分化百分率为 30-40%，较未转染细胞 60-70%的分化率低。 这 些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光，免疫组化染色显示具心肌细胞特异的 I WP=5 cTnT 分子标志。该 EGFP 标记的干细胞系带有可进行原位、实时检测的绿色荧 光，可应用于细胞移植和体内分化的研究。 胚胎干细胞在添加分化抑制物胚胎成纤维细胞或LIF等适宜的培养条件下， 在体外长期能够一直增殖保持未分化状态和全能性，撤除分化抑制物则进入分化 状态，在体外悬浮培养时，胚胎干细胞形成三维聚集体－拟胚体（embryoid bodies，EBs）。EBs是来自一个或多个能够形成或具有潜能形成来自三胚层细胞 的多能干细胞的分化细胞聚集体。尽管EBs在ESC分化的过程中扮演着重要角色， 但对于EBs形成方法和形态上的研究资料仍然很少。本研究除了使用传统的悬滴 法以外，建立了STO法等其他方法获得EBs，以心肌样细胞发育作为模式系统比 较细胞增殖和分化，以ESC是否形成搏动心肌细胞检测在不同分化培养体系中比 较正常EB的形成。结果表明以所建立的STO法、悬浮法、胶原酶法与传统的悬 滴法相比，均可以得到不同比例的出现搏动心肌的EBs，统计结果显示只有STO 法得到的EBs数与悬滴法相比无显著性差异，p0.05；而悬浮法和胶原酶得到的 EBs数低于悬滴法，具有显著性差异（p0.05）。形态研究表明，所得到的EBs经 过了简单拟胚体（sEB）发育为囊状拟胚体（cEB）或成熟拟胚体（mEB），EBs 细胞先出现表层细胞分层，其次EBs中心一个或多个部位出现空腔，透射电镜下 空腔边周的细胞形态改变呈柱状，明显不同于EBs中的未分化细胞。在EBs中仍 然存在很多圆形的未分化细胞，细胞核大突出，核质比例高，胞质浓厚，胞质内 可见少的线粒体和内质网等细胞器。