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狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建

殷相平  
【摘要】:狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的致死性人畜共患传染病。用狂犬病疫苗进行预防注射是预防和控制狂犬病发生的有效途径。现用疫苗具有较好的免疫效果,但受生产成本昂贵及给药方式等因素的限制,不便应用于各种野生和家养动物的免疫接种。重组腺病毒载体具有宿主范围广、对外界环境有一定的抵抗能力以及可口服诱导免疫等优点,可作为基因工程狂犬病疫苗的优良载体。研究和开发重组复制缺陷型腺病毒的狂犬病疫苗将有望预防控制甚至根除我国狂犬病的发生。 狂犬病病毒共有5种结构蛋白,其中糖蛋白(glycoprotein,GP)与病毒的感染和免疫有密切关系,一直是重组疫苗的研究热点;核蛋白(Nucleoprotein,NP)是除GP以外具有免疫原性的另一种重要结构蛋白,近年来倍受研究者的关注。试验选用狂犬病病毒CVS毒株经脑腔攻击后发病小鼠的脑组织,提取总RNA,用带接头的特异性引物进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),分别扩增出狂犬病病毒NP基因和GP基因,将NP基因和GP基因克隆入质粒载体pMD18-T,对筛选所获得的含有NP和GP基因的重组质粒进行全基因序列测定,然后用DNAStar软件进行序列对比分析,结果表明成功地克隆出具有强神经毒力的狂犬病病毒CVS毒株的NP基因和GP基因。 本研究将狂犬病病毒GP基因和NP基因串联,利用复制缺陷型腺病毒载体首次成功构建了同时携有GP和NP的重组腺病毒。在构建重组腺病毒的试验中,首先将GP基因和NP基因分别从其各自的克隆载体上双酶切消化,然后再将GP和NP基因同时亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经卡那霉素抗性和酶切筛选获得了含有G+N的重组穿梭质粒-pAdTrack-CMV/G+N。然后采用在生长周期短、便于操作的大肠杆菌细胞内高效同源重组的方法,即将此重组穿梭质粒电击转化含有腺病毒骨架载体质粒的大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得了插有外源基因的重组腺病毒质粒。最后,经PacⅠ酶切以释放病毒反转录末端重复序列为自由末端,以此重组感染性腺病毒基因组DNA转染293细胞,成功地得到含有狂犬病病毒G+N双基因的重组腺病毒。本试验为狂犬病病毒CVS毒株G+N双基因编码的重组复制缺陷型腺病毒疫苗的研制奠定了基础。


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