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A型口蹄疫病毒结构蛋白VP_1基因的克隆及其在E.coli中的表达

裴仉福  
【摘要】:口蹄疫是由口蹄疫病毒引起牛、羊、猪等偶蹄动物感染的一种急性、高度接触性传染病,其病毒粒子主要由4种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝所组成,其中结构蛋白VP1内包含口蹄疫病毒的主要抗原位点,能诱导中和抗体产生,第141~160和200~213位氨基酸残基构成口蹄疫病毒的主要抗原表位。同时口蹄疫病毒的VP1基因极易发生变异,常可导致毒株抗原性及毒力的变化,也是口蹄疫病毒多型、多亚型的主要原因,因此VP1在口蹄疫研究中占有重要地位。 本试验从牛舌皮组织中提取总RNA,用设计的特异性引物,采用反转录聚合酶链式反应法获得了长度约为750bp左右的核酸片段,与预期长度相符。扩增产物连接到pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109菌株,筛选氨苄青霉素抗性菌落,提取质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序证明,所克隆的750bp左右的片段含有完整的VP1基因。根据VP1基因核苷酸序列,对A/FC/72株与七个参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明A/FC/72株与XJ-I-99株的遗传关系高度相近,而与国外分离毒株的遗传关系相对较远。将重组质粒pGEM-FCVP1和表达载体pGEX-4T-1同时用EcoRΙ和 XhoΙ酶切后,构建成重组表达质粒pGEX-FCVP1,转化宿主菌BL21(DE3)pLySs,经酶切及PCR扩增鉴定筛选出阳性克隆。测序证明,目的基因正确插入到表达载体,用IPTG 诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE和Western blot分析检测,结果表明口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠杆菌中能高效表达,并能被口蹄疫A型阳性血清识别。经凝胶薄层扫描分析表达蛋白约占菌体蛋白总量的30%,表达的目的蛋白的分子量约为26.3ku。进一步的试验证明表达的目的蛋白以包涵体的形式存在。


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