虫生菌四脊裸胞壳（Emericella quadriclineata）Dh菌株生理特性、致病性和分子生物学研究

【摘要】： 由于化学农药的大量使用对生态环境造成了严重的影响,生物防治日益受到人们的重视。虫生真菌以其安全有效,流行潜力显著,容易生产等优点,在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。四脊裸胞壳(Emericella quadriclineata)Dh菌株作为虫生真菌,对尺蠖等鳞翅目害虫具较强的致病性,用其控制草地、林地生态系统中的害虫种群数量,有较广阔的应用前景。 本论文对Dh菌株生物学特性,培养条件对菌丝生长、孢子萌发的影响,胞外酶产生的特性等进行了系统深入的研究;测定了该菌株对几种害虫的致病作用及苜蓿钩麦蛾幼虫受感染后体内保护酶活性变化;利用RAPD多态性技术及rDNA ITS序列分析,对Dh菌株及其相近种进行了亲缘关系和遗传性分析。主要结果如下: 1.通过对Dh菌株生物学特性测定,表明该菌株喜温,生长温度范围为15～45℃,最适温度为30℃;在pH4～8之间生长良好;孢子萌发温度范围为8～45℃,以30℃为最适;能利用葡萄糖、蔗糖等多种碳源,在可溶性淀粉、甘露醇和麦芽糖为碳源的培养基上生长最好;可利用多种氮源,尤其对尿素、氯化铵的利用最好。 2.该菌株胞外蛋白酶在粘虫虫尸培养基和明胶培养基上均可产生,在明胶—琼脂平板培养基上不同温度条件下培养3d后,用15%HgCl处理,菌落周围显示出清晰透明的环状,在33℃温度下产酶量达到最大值,随后减少;几丁质酶产酶高峰出现在4～5d。在含1.5×10~6个分生孢子/mL的PD培养液中,恒温(25℃±1℃)下振荡(120r/min)培养3.5d,产淀粉酶量最大,为272.42U/mg;培养液初始pH4～6最有利淀粉酶的产生,培养4d产酶量为1377.20～1528.99u/mg。温度和pH对淀粉酶活性的稳定性有一定的影响,在50℃,pH6.0条件下酶活性最高,在pH4～7范围内20℃下处理20min,或37℃下处理1h酶活性较为稳定,保持在65%以上。一定浓度的Cu~(2+)和Ba2+有利于酶活性的提高,但Mg~(2+),Fe~(2+),Ca~(2+),NH_4~+对酶活性的抑制作用依次增强。 3.通过在液体和平板培养中研究光周期对Dh菌株菌丝生长及产孢量的影响,结果表明,①光照对液培菌丝生物量和平板培养产孢有明显的影响,长光照液培有利于菌丝生长,其菌丝生物量明显高于短光照和全黑暗;培养96h菌丝生物量最大,其中以18h光照与6h黑暗交替菌丝生物量最大,通过拟合逻辑斯蒂生长模型,也以上述组合的K值最大,菌丝生物量达35mg/ml左右,与观察值相吻合。②光照对Dh菌株