芪蛭皱肺颗粒调控肺泡Ⅱ型上皮细胞NF-κB信号通路的研究

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种破坏性的肺部疾病,以不完全可逆性的气流受限为特征,通常呈进行性发展,多于有害气体或颗粒导致的肺部异常炎症反应有关。COPD虽然可以进行预防与治疗,但仍具有高发病、高致残、高致死率等特点。研究发现,气道和肺实质的慢性炎症是COPD发病的重要机制。有多种炎症介质参与C0PD的发生发展过程,并能引起小气道纤维化及肺结构的破坏,病灶处释放的炎性介质,既会加重肺局部炎症反应,同时也可激活外周血中的炎症细胞,引起全身性的炎症反应。目前的研究发现,调节炎症反应是改善COPD症状、延缓疾病进程的重要途径,而控制炎症介质的释放可能是治疗COPD有效性的体现以及抗炎治疗的作用点。COPD的炎症反应涉及多种细胞,肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell,AT-Ⅱ)是最重要的肺上皮细胞之一,其具有很高的分化潜能,不仅能自我增值,还能转分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞,并参与机体的免疫防御,具有调节肺水转运以及分泌肺表面活性蛋白等功能,在COPD的研究中备受重视。核因子-?B(NF-?B)信号通路广泛存在于机体各类组织中,IL-6、IL-12等多种炎症介质的表达受其调控,其不仅参与机体的炎症反应,还与细胞增殖、抗凋亡等生理效应密切相关。研究认为,调控NF-?B信号通路是抑制肺部炎症反应以及治疗COPD的重要途径之一。本实验就芪蛭皱肺颗粒对AT-Ⅱ细胞NF-?B信号通路的调控作用进行观察,探讨NF-?B信号通路在芪蛭皱肺颗粒控制COPD炎症反应中所起的作用,为探明芪蛭皱肺颗粒防治COPD的作用机制提供实验依据。目的观察芪蛭皱肺颗粒对AT-Ⅱ细胞中NF-?B信号通路的调控及对炎性介质基因转录水平的影响,为探明芪蛭皱肺颗粒对COPD炎症反应的调控作用提供实验依据。方法参照前期实验中的细胞培养方法进行AT-Ⅱ细胞原代培养,用电镜及SP-B免疫组化染色鉴定AT-Ⅱ细胞;选取5瓶生长状态良好的AT-Ⅱ细胞,分为空白组、模型组、芪蛭皱肺颗粒低、中、高剂量组。空白组细胞正常条件培养,其余各组细胞均以20μg/ml LPS进行干预,芪蛭皱肺颗粒给药组在LPS干预2h后,分别给予不同浓度的芪蛭皱肺颗粒,给药浓度依次为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml,各组细胞均在培养36-48h后收集,进行相关检测。(1)倒置显微镜观察细胞一般生长状态,MTT检测细胞活力;电镜及免疫组化SP-B染色鉴定AT-Ⅱ细胞。(2)Q-PCR检测CD14、TLR-4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录水平。结果(1)MTT结果显示,原代培养的AT-Ⅱ细胞在培养前10天内,细胞生长状态良好,在0~72h细胞增殖最为活跃;电镜下观察到,AT-Ⅱ细胞中存在大量深色颗粒,此为AT-Ⅱ细胞特征性结构(板层小体);原代培养的AT-Ⅱ细胞采用SP-B免疫组化染色后,经显微镜观察发现视野中无未着色细胞,(以细胞内着染棕黄色为阳性结果),表明以此方法培养的AT-Ⅱ细胞纯度高。(2)Q-PCR结果显示:与正常组比较,模型组CD14、TLR4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录明显增加,差异有统计学意义(P0.05);与模型组比较,芪蛭皱肺颗粒干预组CD14、TLR4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录水平有不同程度降低,芪蛭皱肺颗粒高剂量组IL-6、IL-12基因转录水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。结论(1)本实验选用的AT-Ⅱ细胞,产量好,纯度高,能满足实验研究需要;(2)LPS可导致AT-Ⅱ细胞CD14、TLR4、NF-?B及炎症介质IL-6、IL-12基因转录增加,该作用是由NF-?B信号通路的调控机制来实现;芪蛭皱肺颗粒通过调控NF-?B信号通路中CD14、TLR4、NF-?B及炎症介质IL-6、IL-12的基因转录水平,抑制AT-Ⅱ细胞的炎症反应,该作用可能是芪蛭皱肺颗粒防治COPD的机制之一。