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久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠TLR4、NF-κB p65及炎性细胞因子表达的影响

许雅清  
【摘要】:目的阐明久泻灵颗粒对脾肾阳虚型UC模型大鼠结肠组织病理形态变化的影响以及对IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ炎症因子和TLR4、NF-κB p65蛋白基因表达的影响,初步阐释以温补脾肾法为指导的中药制剂久泻灵颗粒治疗UC的作用机理和科学内涵,为临床治疗UC用药的探讨提供有效的理论依据。方法1将60只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组和模型组,采用灌服大黄水煎液加肌肉注射氢化可的松的方法建立中医证型“脾肾阳虚”模型,同时结合TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)加50%乙醇混合灌肠法建立西医病“UC”模型。造模成功后将模型组随机分为脾肾阳虚型UC模型7天、14天、21天组,取材后进行结肠组织病理切片制备,采用ELISA法检测FT3、FT4、T的含量。2将90只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组和模型组,造模方法和实验一相同。造模成功后将模型组随机分为脾肾阳虚型UC模型组、久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组和阳性对照组(SASP组)。久泻灵颗粒治疗组按各组要求分别给药7天、14天、21天,阳性对照组给予柳氮磺胺吡啶治疗。取材后选用病理学方法(肉眼观察和HE染色镜下观察)来观察各组大鼠结肠组织病理形态变化、ELISA法检测大鼠血清及组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量、免疫组化法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达、RT-q PCR法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65基因的表达。结果1 ELISA法检测大鼠血清中FT3、FT4、T的含量:与空白组比较,模型7天、14天、21天组中FT3、FT4、T的含量均有所降低,其中模型21天组差异显著(P0.01)。2 ELISA法检测大鼠血清及组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量:与空白组比较,UC模型组中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均有所升高,具有显著性差异(P0.01);与模型组比较,久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组及阳性对照组中各炎症因子的含量均有所降低(P0.01或P0.05),且以中药治疗21天组差异最为显著(P0.01)。3 RT-q PCR法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65 m RNA表达:与模型组比较,空白组结肠组织中TLR4、NF-κB p65 m RNA表达量明显低于模型组(P0.01),差异有统计学意义;久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组结肠组织中TLR4、NF-κB p65 m RNA表达量均有所降低(P0.01或P0.05)。4免疫组化法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达:TLR4表达:(1)镜下观察可见:模型组大鼠肠粘膜上皮和固有层单个核细胞都有TLR4阳性表达,表达强度高于空白组,并且越接近肠腔表达越强。其余各治疗组大鼠TLR4呈弱度或中等强度表达。(2)TLR4阳性细胞灰度值结果为:与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中TLR4表达显著增强(P0.01),差异有统计学意义;与模型组比较,治疗后其他各组TLR4表达均有所减弱(P0.01或P0.05)。NF-κB p65表达:(1)镜下观察可见:模型组中NF-κB p65阳性表达为单核-巨噬细胞,呈现胞浆阳性,大鼠结肠粘膜上皮和固有层单个核细胞中都可以见到,表达强度明显高于空白组。其余各治疗组大鼠NF-κB p65阳性细胞呈弱度或中等强度表达。(2)NF-κB p65阳性细胞灰度值结果为:与空白组比较,模型组NF-κB p65表达显著增强(P0.01),差异有统计学意义;与模型组比较,治疗后各组NF-κB p65表达显著减弱(P0.01或P0.05)。结论1脾肾阳虚是UC反复发病,病情迁延难愈的关键病机,以温补脾肾法为指导的久泻灵颗粒治疗UC疗效显著,为临床用药提供了有效依据。2久泻灵颗粒可以明显降低脾肾阳虚型UC模型大鼠血清及结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ炎症因子的含量,进而抑制炎性细胞浸润,减少炎症活性产物的释放,减轻机体肠粘膜的炎症反应和组织损伤程度,促进肠粘膜修复。3久泻灵颗粒可以明显降低脾肾阳虚型UC模型大鼠中TLR4、NF-κB p65基因的转录和蛋白的表达,减轻粘膜炎症反应,促进肠粘膜修复。


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