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活性维生素D3通过wnt/β-连环蛋白信号通路抑制TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞转分化研究

刘萍  
【摘要】:目的 通过观察活性维生素D_3(1,25-(OH)2D3)对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)间充质转分化以及wnt/β-catenin信号通路的影响,探索活性维生素D3延缓肾脏纤维化进展的可能机制,为活性维生素D3临床延缓慢性肾脏病进展提供实验依据。方法 角质细胞培养基体外培养HK-2细胞,第一部分:筛选活性维生素D3最佳效应剂量,先将HK-2细胞分为五组,(1)正常对照组;(2)TGFβ1组(10ng/ml);(3)TGFβ1(10ng/ml)+10~(-7)mol/l活性维生素D3组;(4)TGFβ1(10ng/ml)+10~(-8)mol/l活性维生素D3组;(5)TGFβ1(10ng/ml)+10~(-9)mol/l活性维生素D3组。培养48小时,显微镜下观察各组细胞形态变化,应用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞α-SMA、E-cadherin mRNA表达变化;Western Blot检测各组细胞α-SMA蛋白表达变化;根据实验结果筛选活性维生素D3的最佳效应剂量。采用划痕试验检测正常对照组、TGFβ1组、TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组三组细胞的迁移能力。第二部分:探讨活性维生素D3抑制TGFβ1诱导的HK-2细胞间充质转分化的可能机制,根据第一部分实验结果将细胞分为(1)正常对照组;(2)TGFβ1组(10ng/ml);(3)TGFβ1(10ng/ml)+10~(-7)mol/l活性维生素D3组;(4)TGFβ1(10ng/ml)+10~(-7)mol/l活性维生素D3+Licl(20mmol/l)组;(5)TGFβ1(10ng/ml)+Licl(20mmol/l)组。体外培养细胞48小时,应用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞E-cadherin、α-SMA、β-catenin mRNA的表达变化;Western Blot检测α-SMA、β-catenin、P-GSK3β、GSK3β蛋白表达变化;细胞免疫荧光检测正常对照组、TGFβ1组、TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组各组细胞β-catenin的表达情况。结果 1.正常对照组HK-2细胞呈鹅卵石铺路状,细胞之间排列紧密,呈片状分布;TGFβ1组细胞呈长梭形或不规则形,细胞间隙增大;TGFβ1+活性维生素D3组多数细胞仍有上皮细胞特征,大部分细胞形态仍呈鹅卵石铺路样排列,随着活性维生素D3浓度的升高,细胞形态变化程度较TGFβ1刺激组逐渐减轻。2.与正常对照组相比,TGFβ1组E-cadherin mRNA表达明显降低,α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P〈0.05);与TGFβ1组相比,活性维生素D3干预组E-cadherin mRNA表达明显升高、α-SMA mRNA及蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义(P〈0.05),且呈剂量依赖性,活性维生素D3浓度越高效果越明显。划痕实验结果显示,正常对照组48h的迁移率为(15.3±1.52)%,与TGFβ1组的迁移率(33.3±3.05)%相比,差异具有统计学意义(P〈0.05);而TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组的迁移率为(25.6±2.08)%,与TGFβ1组相比明显降低,差异具有统计学意义(P〈0.05)。3.与正常对照组相比,TGFβ1组P-GSK3β/GSK3β蛋白、β-catenin mRNA及蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P〈0.05);而TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组P-GSK3β/GSK3β蛋白、β-catenin mRNA及蛋白表达量明显低于TGFβ1组,差异具有统计学意义(P〈0.05);与TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组相比,TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3+licl组P-GSK3β/GSK3β蛋白、β-catenin及α-SMA mRNA及蛋白表达均明显上调,E-cadherin mRNA表达明显下调,差异具有统计学意义(P〈0.05)。与TGFβ1组相比,TGFβ1+Licl组P-GSK3β/GSK3β蛋白、β-catenin及α-SMA mRNA及蛋白表达均明显上调,E-cadherin mRNA表达明显下调,差异具有统计学意义(P〈0.05)。免疫荧光结果显示,正常对照组,β-catenin主要表达于HK-2的胞膜及胞质,TGFβ1组HK-2胞质与胞核的β-catenin表达增强,β-catenin向核内积聚,TGFβ1+10~(-7)mol/l活性维生素D3组胞核的β-catenin表达明显下降。结论 1.活性维生素D3可能通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制HK-2细胞转分化,提示活性维生素D3可延缓慢性肾脏病肾纤维化进展。


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