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Leukamenin E对人早幼粒白血病细胞HL-60生长抑制、凋亡诱导及细胞骨架的影响

第五佳丽  
【摘要】:香茶菜属植物在我国种类繁多,分布广泛,从香茶菜属中提取出的多种化合物,以其高效低毒的作用亦广泛应用于抗肿瘤的治疗,而对映-贝壳杉烷二萜类化合物是香茶菜属植物中含量最为广泛,特征最为典型化合物,研究证实,该化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤及免疫调节等多重生物活性,在抗肿瘤活性方面已呈现出相当大的潜力。近年来,从冬凌草中分离得到的对映-贝壳杉烷类二萜冬凌草甲素(Oridonin)在治疗白血病方面有突破性的进展,并以进入临床治疗阶段,而类似分子结构的对映-贝壳杉烷二萜类化合物的抗白血病细胞株的相关研究报道却很少,大都通过凋亡通路来对二萜化合物抗肿瘤机制做一初步探究。Leukamenin E是从甘肃产拟缺香茶菜中分离得到的对映-贝壳杉烷型二萜化合物,研究显示该化合物该化合物有较强的细胞毒性,但其抗癌活性的机理却仍不明确,尚需进一步研究。目前,有关Leukamenin E对白血病细胞骨架的影响研究尚未见文献报道。 本论文以对映-贝壳杉烷二萜类化合物Leukamenin E为受试药物,以人早幼粒白血病HL-60细胞为处理对象,分别利用MTT法和台盼蓝排染法检测了该药物作用下HL-60细胞的活性及其对HL-60细胞生长抑制的作用,并对该药物对细胞周期的影响及诱导凋亡的情况进行了研究,同时,通过对核的染色以及制备分裂中期染色体观察细胞核及细胞的变化,最后,利用间接免疫荧光和荧光染色法,对细胞骨架微丝、微管及波形蛋白的影响进行观察,进一步探究该化合物的作用机理。主要结果如下: 1. Leukamenin E对HL-60细胞有较强的细胞毒性,表现为低浓度条件下抑制细胞生长,高浓度条件下具有致死作用,存在时间-剂量效应。MTT法检测细胞毒性结果显示,该化合物作用HL-60细胞的IC_(50)=0.89±0.15μmol/L。 2.随着Leukamenin E药物浓度的增加,该化合物显著地影响了HL-60细胞周期的分布,引起了显著的细胞S期阻滞,抑制细胞生长,进而产生凋亡。 3.利用荧光染料Hoechst33258对细胞进行染色后结果显示,该化合物可以引起HL-60细胞趋向多核形成。 4.对Leukamenin E作用的细胞进行了染色体的统计,发现染色体数目随着浓度的增加大量增多,出现染色体数目为86~118个的分裂期细胞,形成多倍体细胞(染色体数目≥80条)。 5.通过间接免疫荧光对细胞微丝骨架进行染色并利用激光共聚焦观察,发现随着药物浓度的增加,微丝随之变化,当较高浓度(2.1~2.7μmol/L)作用时,细胞周围红色亮环断开,细胞内颗粒状荧光增强,聚集成团。同时,观察到有凋亡小体形。 6.通过间接免疫荧光对细胞微管骨架进行染色并利用激光共聚焦观察,随着药物浓度的增多,微管蛋白明显增多且都呈现不规则状细丝结构或网状结构,当药物浓度≥2.4μmol/L时,微管蛋白分布密度大量增大,极不均匀,出现密集、紊乱的纤维束,毫无规则完全覆盖在细胞表面,呈浓度依赖性,与对照组相比,变化十分明显。 7.通过间接免疫荧光对细胞波形蛋白进行染色并用免疫荧光显微镜观察,随着浓度的增加,与对照相比,细胞内出的现聚集斑块变大荧光变亮,出现聚集斑块的细胞开始增多,并且呈现高亮荧光团。 总之,Leukamenin E对人早幼粒白血病细胞有较强的毒性,作用于HL-60细胞后,抑制细胞生长,引起显著的S期阻滞,并伴有凋亡产生,并具有时间-剂量效应。同时,该化合物还可以使细胞产生多核,引起多倍体细胞产生;同时,HL-60细胞经化合物处理后,对细胞内微丝影响较小,但微管蛋白明显增加,而波形蛋白纤维则出现聚集现象。本研究首次检测了对映-贝壳杉烷型二萜化合物Leukamenin E对HL-60细胞骨架的影响,为进一步探究此药物抗癌作用的机制提供了一定的科学依据。


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