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兰州百合糖蛋白(LGP)的结构表征与免疫调节活性研究

王铖博  
【摘要】:糖蛋白是一种糖类与蛋白质通过共价键结合在一起的生物大分子。糖蛋白种类繁多,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,以多种形式存在于生物体内,在机体生命活动中起着复杂而重要的功能。研究表明,糖蛋白具有多种生物学活性,在免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等方面有着重要的作用。因此,糖蛋白在功能性食品及药物研究等领域有着广阔的开发前景。本文以兰州百合作为研究对象,以超声辅助缓冲溶液提取得到兰州百合糖蛋白组分,对其进行结构表征及理化性质研究,并以小鼠巨噬细胞系RAW 264.7为细胞模型,研究了兰州百合糖蛋白纯化组分在细胞水平的免疫调节活性。论文主要包括以下几个部分:(1)新鲜兰州百合鳞片经一系列预处理后,石油醚回流脱脂,以pH 7.4的0.01 mol/L PBS缓冲溶液提取,盐析分离糖蛋白组分,透析、冷冻干燥得到兰州百合糖蛋白粗品LGP,得率为2.09%;粗品复溶后,使用Sephadex G-200凝胶柱及DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱进一步纯化,HPLC和Sephadex G-100进行纯度鉴定,得到了糖蛋白的两个纯化组分LGP-1和LGP-2。(2)对纯化得到的LGP-1和LGP-2进行结构表征及理化性质研究。LGP-1的糖含量和蛋白质含量分别为55.80%和43.04%,LGP-2的糖含量和蛋白质含量分别为62.52%和35.28%;红外光谱(FT-IR)结果表明,LGP-1和LGP-2均具有糖和蛋白质的特征吸收峰;分子量测定结果为,LGP-1的重均分子量(Mw)为3.639×10~4,而LGP-2则为9.311×10~4,分散系数LPG-1为1.950,较LGP-2的2.927更小;β-消去反应结果表明,LGP-1和LGP-2均含有O-连接的糖肽键;气相-质谱联用测得LGP-1由甘露糖和葡萄糖组成,其摩尔比为1.07:1.01,LGP-2则由甘露糖、葡萄糖和半乳糖三种单糖组成,其摩尔比为1.04:4.64:5.43;氨基酸组成分析结果表明,LGP-1由16种氨基酸组成,不含有甲硫氨酸,而LGP-2则由15种氨基酸组成,缺少甲硫氨酸和酪氨酸,LGP-1和LGP-2中均含有大量的人体必需氨基酸;圆二色谱图表明,LGP-1与LGP-2的蛋白质主链二级结构均以β-折叠为主;扫描电子显微镜观察发现,LGP-1呈现大小比较均一、表面光滑的球型或椭球型,而LGP-2则呈现出立方体的表观形态,LGP-1的粒径分布在0.3~0.9μm范围之内,LGP-2的粒径分布在0.6~1.8μm范围之内。(3)以小鼠巨噬细胞系RAW 264.7研究LGP-1和LPG-2的免疫调节活性。CCK-8实验研究对细胞活力的影响,结果表明,两者均可显著促进RAW 264.7细胞的增殖,且呈现浓度依赖性。Griess法测定NO的释放能力、ELISA法测定TNF-α的分泌,判断LGP对RAW 264.7细胞的免疫调节作用。结果表明,当细胞培养时间为48 h,加样浓度达到100μg/mL时,NO释放量和TNF-α含量达到最大。由此可知,LGP-1和LGP-2均能促进RAW 264.7细胞的增殖,并且能够激活该细胞的免疫功能,由此推测兰州百合糖蛋白组分有着很好的免疫调节活性和抗肿瘤活性。上述兰州百合糖蛋白的结构表征及免疫调节活性的研究,迄今尚未见相同文献报道。


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