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DNA分子荧光探针的研究

王海燕  
【摘要】: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)又称去氧核糖核酸,是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基础,可组成遗传指令以引导生物发育和生命机能运作,可比喻为“蓝图”或“食谱”,在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动中起着非常重要的作用。定量测定是研究DNA的基础,DNA分子的定量分析、特异识别等对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。DNA探针是最常用的核酸探针,但是由于DNA内源荧光很弱,导致直接利用其荧光测定受到限制。溴化乙锭(EB)是应用最早也是应用最广的荧光探针,可用于核酸的定性定量分析,也可以用于核酸杂交动力学特性的研究,而溴化乙锭的高致癌性使其进一步应用受到很大挑战,所以人们开始寻找新的探针。本人在前人研究的基础上做了一些工作,在DNA分子探针方面有了一些研究进展,本论文主要包括以下四部分的内容: 第一部分,根据本文研究的重点,主要介绍了脱氧核糖核酸(DNA)分子的组成与结构特点、荧光产生的理论基础、DNA分子荧光探针的类型、DNA分子与探针分子或离子的作用方式及研究方法等方面进行综述。 第二部分,用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色谱、凝胶电泳等方法研究了基于1,1-二苯基-2(2,5-环己二烯)乙烯基团的有机染料铬天青S、甲基紫、甲基绿、结晶紫和邻苯二酚紫与ct-DNA的键合相互作用,并将所得结果与EB-DNA体系进行比较。在上述五种染料中,铬天青S和结晶紫对ct-DNA体系的荧光有较强的增强作用,而甲基紫、甲基绿对该体系产生强烈的荧光猝灭作用;紫外-可见吸收光谱,随着ct-DNA浓度的增加,铬天青S、甲基紫和结晶紫表现出减色效应,甲基绿和邻苯二酚紫表现出增色效应;琼脂糖凝胶电泳试验中只有铬天青S-DNA体系与EB-DNA体系呈现较强的发光强度。从而初步断定可用铬天青S代替有高致癌性的EB,为安全、不造成环境污染定量测定核糖核酸提供了新试剂使用基础。 第三部分,利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶电泳等方法系统比较了苯基芴酮、曙红B以及EB与ct-DNA的光谱学作用。在ct-DNA存在时,苯基芴酮、曙红B和EB的荧光强度都有不同程度的提高;紫外-可见吸收光谱随ct-DNA浓度的增加,表现出减色效应;二者均使ct-DNA的圆二色谱正负峰吸收强度有所增加;凝胶电泳实验中,苯基芴酮-DNA体系、曙红B-DNA体系与EB-DNA体系的发光强度不相上下,故在DNA的定量测定中,可用无毒副作用的苯基芴酮或曙红B代替有高致癌性的EB,为安全、减少环境污染定量测定核糖核酸提供了新试剂使用基础,也为寻找更合适的DNA分子荧光探针提供实验基础。 第四部分,利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶电泳等方法系统比较了碱性藏花红、变色酸以及EB与ct-DNA的光谱学作用。在ct-DNA存在时,化合物的荧光强度增加;紫外-可见吸收光谱随ct-DNA浓度的增加,表现出减色效应;ct-DNA的圆二色谱正峰吸收强度有所增加;琼脂糖凝胶电泳实验证明碱性藏花红和变色酸可用来替代溴化乙锭作为DNA分子荧光探针。对于经过试验能够替代EB作为DNA分子荧光探针的染料,如何改良和提高荧光探针的灵敏度还有待进一步研究。


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