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Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用

杨易  
【摘要】:结核病(Tuberculosis,TB)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染而引起的慢性致死性人畜共患传染病。结核病发病机制研究大多集中在Mtb与肺泡巨噬细胞、树突状细胞之间的相互作用,也有研究表明肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial Cells,AEC)同样是Mtb的靶细胞,在抗结核分枝杆菌感染中起着至关重要的作用,但肺泡上皮细胞与结核分枝杆菌相互作用的分子机理尚未阐明。最新研究发现,肺泡上皮细胞Wnt信号可通过与膜受体蛋白结合发挥免疫调控作用。Wnt5a是分泌型糖蛋白类Wnt家族中的重要成员之一,可激活非经典Wnt信号通路,参与细胞炎性反应的分子调控;而SOX2与包括Wnt信号在内的多种细胞信号都有交互式相互作用,是细胞自噬、炎症、凋亡、发育等过程的重要调节器。为揭示Wnt5a信号在肺泡上皮细胞抗结核菌感染中的免疫调控作用,本研究主要解决的关键科学问题为:1.结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞后是否激活Wnt5a和SOX2信号?2.Wnt5a信号和SOX2信号是否参与调控结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞的凋亡过程及TLR信号介导的炎性反应?二者间相互作用的分子机制是什么?本研究在结核分枝杆菌疫苗株BCG感染肺泡上皮细胞A549基础上,分别采用Wnt5a条件培养基、JNK抑制剂SP600125激活或抑制Wnt5a/JNK信号通路,慢病毒过表达SOX2转染A549细胞方式,结合MTT比色法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术和酶联免疫吸附测定等技术,检测Wnt5a信号通路相关蛋白、TLR信号通路相关蛋白及炎性细胞因子、细胞凋亡相关蛋白的表达水平,探究Wnt5a、SOX2在Mtb感染肺泡上皮细胞A549中的调控作用及其机制,取得如下研究结果:1.Mtb感染A549细胞后,Wnt5a信号通路的关键分子Wnt5a、Ror2、JNK和CamKⅡ在mRNA水平的表达显著上调;与未感染对照组相比,在Wnt5a或BCG单独刺激下,A549细胞中Wnt5a、PKC、CamKⅡ、Fzd5、Ror2和JNK蛋白表达水平显著上调,且Wnt5a与BCG共处理组中Wnt5a、PKC、Fzd5和JNK的表达显著高于BCG单独处理组(P0.05);在抑制剂SP600125处理BCG、Wnt5a单独或共同作用的A549细胞后,与对照组相比,各处理组中Wnt5a、Ror2、JNK、p-JNK和AP-1蛋白表达水平均下调,差异极显著(P0.01)。结果表明:Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后Wnt5a信号通路的开启,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的Wnt5a信号具有抑制作用。2.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对TLR信号关键分子及炎性细胞因子进行检测,BCG 组和 Wnt5a+BCG 组中 TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化 NF-κBp65和IRF5的表达均显著上调,与未感染对照组相比差异极显著(P0.01),且Wnt5a+BCG组的表达水平高于BCG组。采用抑制剂SP600125处理A549细胞后,BCG组、Wnt5a+BCG组分别与未处理对照组相比,TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化NF-κBp65和IRF5的表达均显著下调(P0.05)。与未感染对照组相比,Wnt5a+BCG组、Wnt5a和BCG组炎性因子IL-6和TNF-α表达均显著上升,且Wnt5a+BCG组共同处理组表达最高,差异极显著(P0.01)。研究结果表明,Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后TLR信号通路的开启,进而促进BCG感染引起的炎性反应,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的TLR信号具有抑制作用。3.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对SOX2蛋白的表达进行检测,Wnt5a组、BCG组和Wnt5a+BCG组中A549细胞SOX2蛋白表达水平均高于对照组,差异极显著(P0.01);采用抑制剂阻断JNK信号后,Wnt5a组、BCG组中的SOX2表达水平显著下调。研究结果表明,BCG和Wnt5a可通过Wnt5a/JNK信号途径激活A549细胞中SOX2的表达。4.Wnt5a与BCG作用于A549细胞后的细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的表达进行检测,结果表明:A549细胞内凋亡小体的数量、细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表达水平、线粒体膜电位下降幅度,细胞内ROS水平,Caspase-3、活化的Caspase-3(C-caspase3)及Cyto C的表达水平均表现为Wnt5a+BCG共处理组BCG感染组对照组,而抑凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平与之相反。与未感染对照组相比,BCG、Wnt5a单独处理组及共处理组A549细胞内的ROS释放量大幅升高,且NAC预处理组较未处理对照组ROS水平有所下降。研究结果表明,Wnt5a/JNK信号通过增强A549细胞内ROS产生经线粒体凋亡途径促进BCG诱导的A549细胞凋亡。5.在过表达SOX2的A549细胞中,Wnt5a、JNK、p-JNK、CamKⅡ和NAFT蛋白表达较对照组下调;经BCG感染A549细胞后,Wnt5a、JNK、p-JNK和NAFT蛋白表达上调,而过表达SOX2+BCG感染组较BCG单独感染组Wnt5a关键蛋白的表达水平下降;在过表达SOX2的A549细胞中,TLR2、TLR4、TBK-1、TRAF3、IRF3、AP-1和NF-KB p65蛋白表达较对照组上调,BCG感染A549细胞同样表现为TLRs关键蛋白表达上调,而BCG+过表达SOX2组TLR2、IRF-5、NF-κB p65、AP-1、TRAF3、TBK-1和IRF-3蛋白及炎性细胞因子IL-6、TNF-α的表达水平高于未感染对照组但低于BCG单独感染组;与未感染对照组相比,BCG+过表达SOX2组及BCG感染组A549后Bax/Bcl-2、C-Cas3、C-Cas8、C-Cas9表达均上调,而BCG+过表达SOX2组的表达水平低于BCG单独感染组。结果表明,过表达SOX2负反馈抑制了 BCG感染A549细胞后的凋亡及TLR信号介导的炎性反应。综上研究结果,Wnt5a和SOX2在结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞的调控作用机制是:结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞后,Wnt5a表达上调,激活了 Wnt5a/JNK非经典信号通路,进而促进了 TLR信号的级联放大,诱导细胞凋亡以清除病原菌的感染;同时,Wnt5a信号通路的激活进一步上调了 SOX2的表达。当SOX2过度表达时,能够负反馈抑制BCG感染的肺泡上皮细胞Wnt5a信号、TLR信号介导的炎性反应及细胞凋亡,从而维持上皮组织细胞的稳态。这些发现将为深入研究结核分枝杆菌与宿主肺泡上皮细胞的相互作用机理,阐明宿主上皮细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫应答调控机制提供新的研究思路。


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