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细粒棘球绦虫原头蚴mRNA测序及生物信息学分析

朱明星  
【摘要】:目的通过对细粒棘球绦虫原头蚴总mRNA进行测序及对测序数据的生物信息学分析,期望揭示细粒棘球绦虫原头蚴转录组遗传信息,为深入了解细粒棘球绦虫原头蚴转录组的生物学特征及其与宿主之间的关系,提供新的包虫病的诊断方法、筛选新的药物靶点和疫苗候选分子,提供了研究数据,积累了研究资料。 方法1.外科手术剥离包虫病人的包囊并分离原头蚴,用TRIzol加液氮研磨法提取原头蚴总RNA,检测总RNA的质量。2.用带有Oligo(dT)的磁珠富集poly(A) mRNA,分离出不少于500ng的原头蚴总mRNA。分离出来的总mRNA被反转录成一链和二链cDNA,并将cDNA片段化,通过QIAquick PCR Purification Kit纯化,纯化后进行末端补平,向补平后二链cDNA的3’端加入碱基腺嘌呤(A),添加接头后的连接产物用2%琼脂糖凝胶回收目的片段并加以纯化,通过PCR富集cDNA模板后回收PCR产物并加以纯化,用Agilent2100检验文库质量。3.构建好的文库用Illumina公司HiSeq2000高通量测序仪进行测序。4.利用Mapping-first方法对测序所得数据进行组装与拼接,最终形成unigene。5.用生物信息学方法对所得到的unigene进行注释,包括与NCBI网站中非冗余的蛋白序列数据库(Non-redundant,Nr)、全球蛋白资源数据库(Universal Protein,UniProt)、基因本体数据库(Gene Ontology,GO)以及日本京都基因和基因组百科全书通路数据库(KEGG Pathway)进行比对,得到具有最高序列相似性的蛋白,从而得到该unigene的蛋白功能注释信息。 结果1.经核酸蛋白微量分析仪测定总RNA OD260/OD280=1.81,conc=42.75μg/ml,符合测序要求。2.通过测序共获得132007609条reads (4Gb),每条reads的平均长度为101bp,其中可用reads的比例为76.1%,Mapping reads的比例为92.8%。这些reads经过组装后共形成91342条unigene,平均长度为419bp,GC含量为43.78%。3.注释结果显示,比对到Nr数据库的unigene为11866条,比对到UniProt数据库的unigene为11294条。通过对基因进行GO分类注释,获得了GO功能注释信息,分别归入到了生物学过程、分子功能和细胞组分3个主要类别,这3个主要类别又被划分为48个更为详细的功能组。通过KEGG pathway的注释,共有6664条unigene注释到了KEGG代谢通路中,参与了6大类生物过程中34个小类的代谢,共227个代谢通路。 结论1.在国内首次对细粒棘球绦虫原头蚴总mRNA进行了深度测序。2.通过对测序结果的生物信息学分析,获得了细粒棘球绦虫原头蚴总mRNA包含的相关信息。3.这些信息为研究细粒棘球绦虫原头蚴与宿主之间的关系,提供新的包虫病的诊断方法,筛选新的药物靶点和疫苗候选分子,提供了研究数据,积累了研究资料。


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