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人肝癌组织中肝癌干细胞的分离培养与鉴定

马俊明  
【摘要】:目的体外分离及培养人肝癌组织中的肝癌干细胞并鉴定其生物学特性。方法收集临床肝癌患者术后肝癌组织,用酶消化法分离肝癌细胞,将其接种于无血清培养基中培养,并在超低粘附24孔板中观察肝癌干细胞克隆球生长情况;用MTT比色法检测肝癌干细胞增值能力;用肝癌干细胞表面标记物CD90、CD133抗体,采用流式细胞仪鉴定并分选CD90+细胞、CD90-细胞,CD133+细胞、CD133-细胞,将4种不同细胞组成CD90+细胞CD133+细胞、CD90-细胞CD133+细胞、CD133-细胞CD90+细胞及CD133-细胞CD90-细胞,分别接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力并记录肿瘤体积;将裸鼠成瘤后的组织进行HE染色。结果在无血清培养基中,肝癌干细胞可以形成少量的细胞克隆球;MTT比色法检测,在连续72小时里,肝癌干细胞克隆球始终处于持续增值状态;采用流式细胞仪检测显示肝癌干细胞表面标记物CD90、CD133阳性率分别是7.2%、8.8%,并成功分选出CD90+细胞、CD90-细胞、CD133+细胞、CD133-细胞,将组成的4种不同细胞组分别接种于裸鼠皮下,结果显示,CD90+细胞CD133+细胞、CD90-细胞CD133+细胞及CD133-细胞CD90+细胞在裸鼠体内均形成肿瘤,且CD90+细胞CD133+细胞组在最短时间内出现了较高的致瘤能力。而CD133-细胞CD90-细胞在整个过程中未见肿瘤形成。将裸鼠体内的肿瘤经HE染色,其结果与人肝癌组织病理特点相似。结论成功建立了从人肝癌组织中分离培养肝癌干细胞的方法;培养得到的肝癌干细胞能在无血清培养基中形成克隆球,且具有较强的增值能力;部分细胞表达CD90+细胞和CD133+细胞,且在裸鼠体内形成肿瘤;肝癌组织中CD90+细胞和CD133+细胞具有肝癌干细胞特性,可能为肝癌干细胞。


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