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宁夏无果枸杞芽提取物对小鼠胸腺淋巴细胞分化与Notch通路信号因子的作用

曹羿堃  
【摘要】:第一部分增龄过程中小鼠胸腺结构、Notch通路信号因子基因表达及淋巴细胞亚群的变化目的通过检测增龄过程中小鼠胸腺组织结构、Notch通路信号因子基因表达及淋巴细胞亚群的变化情况,分析小鼠年龄增长与胸腺各种变化之间的关系,从而探讨免疫与衰老的关系,并为下一步观察宁夏无果枸杞芽提取物对自然衰老小鼠胸腺Notch通路信号因子与淋巴细胞分化的影响提供理论和实验依据。方法选取2周龄、4周龄、6周龄、8周龄、16周龄、24周龄健康雄性C57小鼠,分为6组,每组15只。利用胸腺指数、HE染色观察增龄过程中小鼠胸腺的变化;应用实时荧光定量PCR法检测增龄过程中小鼠胸腺细胞NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因表达的变化;应用流式细胞术检测增龄过程中小鼠胸腺淋巴细胞亚群分化的情况。结果1、随着年龄增加,小鼠胸腺指数逐渐减小,24周龄小鼠胸腺指数最小,与其它各周龄组比较,有统计学意义(P0.05);2、HE染色显示,2、4、6周龄小鼠胸腺组织结构正常,各组间变化不大,8周龄胸腺皮质变薄,16周龄胸腺开始萎缩,24周龄胸腺萎缩程度加深,表现为:皮质变薄,细胞稀疏、散乱分布,皮质与髓质交叉现象严重,皮髓质界线消失;3、荧光定量PCR结果显示,小鼠胸腺细胞NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因m RNA的表达均呈随年龄增大表达量增加的趋势,24周龄表达量减少,与前面几组相比,具有统计学意义(P0.05);4、流式细胞结果显示,随年龄增长,小鼠胸腺内CD4+CD8+细胞比例减少,CD4+细胞和CD8+细胞比例呈上升趋势,24周龄降至最低,与前面几组相比,有统计学意义(P0.05),2、4、6、8周龄胸腺CD4+/CD8+比值逐渐增加,16周龄开始下降,24周龄降至最低,与前面几组相比,有统计学意义(P0.05),CD28分子的表达呈上升趋势,24周龄开始下降,与前面几组相比,有统计学意义(P0.05)。5、对Notch信号因子基因表达和T细胞亚群比例进行相关性分析,发现24周龄前的阶段NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ与CD4+CD8+双阳性细胞及CD4+单阳性细胞无相关性,与CD8+呈正相关。第二部分宁夏无果枸杞芽提取物(FLE)对小鼠Notch通路信号因子的表达及淋巴细胞亚群分化的影响目的本实验通过观察给予宁夏无果枸杞芽提取物前后各组小鼠胸腺指数、胸腺结构、小鼠胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号因子NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ表达的变化,明确FLE对小鼠胸腺结构、胸腺淋巴细胞亚群分化的影响及与Notch通路的关系,探讨FLE影响免疫衰老的可能的机制,为宁夏无果枸杞芽抗衰老研究提供实验依据。方法将60只24周龄健康雄性C57小鼠随机分为4组:空白对照组、FLE低剂量组、FLE中剂量组和FLE高剂量组,每组15只。分别用质量/体积百分比为4%、8%、16%FLE灌胃,0.2 m L/(10 g·d)),空白对照组等量生理盐水灌胃,连续8周。灌胃结束后,处死小鼠并取材,HE染色观察各组小鼠胸腺结构、应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠胸腺细胞NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因的表达、应用流式细胞术检测小鼠胸腺淋巴细胞亚群的分化情况。结果用宁夏无果枸杞芽提取物灌胃小鼠8周后,无果枸杞芽中、高剂量组可明显改善胸腺萎缩和结构的退化;PCR法检测显示:无果枸杞芽灌胃组小鼠胸腺组织NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因的表达量降低;流式细胞术结果显示:宁夏无果枸杞芽对CD4+CD8+双阳性细胞的改变不明显,可明显升高CD4+单阳性细胞比例,同时降低CD8+单阳性细胞比例,升高CD4+/CD8+比值,增加CD28分子的表达。结论本实验结果显示宁夏无果枸杞芽提取物可明显改善小鼠胸腺萎缩状况,能够降低NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因的表达量,增加CD4+单阳性细胞分化的同时抑制CD8+单阳性细胞分化,升高CD4+/CD8+比值,提示宁夏无果枸杞芽可改善衰老所致胸腺萎缩,与无果枸杞芽提取物增加CD4+单阳性细胞分化,抑制CD8+单阳性细胞分化,升高CD4+/CD8+比值,维持CD4+和CD8+单阳性细胞数目,降低NotchⅠ、PSⅠ、PSⅡ、HES-Ⅰ基因的表达有关。


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