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条件性敲除海马与新皮质内GABRG2小鼠的构建及其对学习记忆的影响

郭胜楠  
【摘要】:目的建立基于Cre/loxp重组酶系统调控的海马和新皮质特异性GABA_A受体γ2亚基(GABRG2)基因条件敲除小鼠模型,为深入研究海马区和新皮质GABRG2在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)发生中的功能作用提供动物模型,评估不同温度条件对小鼠癫痫发作的影响,并进一步探讨该基因对小鼠学习、记忆及认知功能的影响。方法1.将引进的GABRG2~(fl/wt)转基因小鼠与海马和新皮质特异性表达Cre~(+/+)重组酶工具鼠分别进行繁配和鉴定,然后再将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为GABRG2~(fl/wt)Cre~+的小鼠为本研究所构建的海马区和新皮质特异性GABRG2基因条件性敲除小鼠。Real-Time qPCR和Western Blotting技术检测GABRG2基因在小鼠海马和新皮质中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。2.利用直肠温度探针法建立热诱发癫痫模型,在不同温度条件下分别观察小鼠癫痫发作情况,记录其发作级别、加热过程中跳跃次数、评估温度升高对癫痫发作的影响。利用皮层植入电极法记录脑电,观察小鼠癫痫发作时脑电变化。3.利用Smart 3.0小动物行为学视频采集与分析系统记录对照组和GABRG2基因敲除组小鼠在黑白箱实验(Light/dark box,LDB)、旷场实验(Open field,OF)、新物体识别实验(Novel object recognition test,NORT)、新位置识别实验(Object location test,OLT)、三箱实验(Three-chamber tests,TCT)中的行为学变化,分析小鼠的焦虑、学习、记忆及认知功能。结果1.琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,子代小鼠基因型符合GABRG2~(fl/wt)Cre~+;Real-Time qPCR和Western结果显示,海马与新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠海马和新皮质中GABRG2基因的mRNA水平和蛋白质水平显著低于对照组。2.热诱发癫痫模型过程中,对照组与GABRG2基因敲除组小鼠相比,实验组小鼠皮层脑电的棘波显著高于对照组;基因敲除组小鼠对热诱导癫痫发作敏感性更高(0.75±0.09vs.0.50±0.06,P0.001),温度升高可以引发全身强制性阵挛癫痫发作。3.黑白箱实验结果显示,在37℃加热孵育30 min后,GABRG2基因敲除小鼠与对照组小鼠相比,其在黑箱中的运动距离(1115.62±283.76 cm vs.1880.53±309.42 cm,P0.001)及穿箱次数(9.38±2.77 vs.32.13±10.11,P0.001)均显著降低,在黑箱停留时间百分比高于对照组(69.82±7.16%vs.60.34±3.34%,P0.01);39.5℃加热孵育30min后,GABRG2基因敲除小鼠在黑箱中的运动距离(646.32±106.32 cm vs.1835.27±278.14 cm,P0.001)及穿箱次数(8.00±2.27 vs.29.13±11.26,P0.001)均显著降低,在黑箱中停留时间百分比(53.27±4.76%vs.65.34±6.34%,P0.01)高于对照组。4.旷场实验结果显示,GABRG2基因敲除小鼠在37℃和39.5℃时,小鼠在旷场周边运动距离显著高于野生组小鼠(3791.80±630.67 cm vs.1552.63±581.86 cm,P0.001)和(3043.45±451.22 cm vs.1368.41±412.79 cm,P0.001),而在中心的运动距离低于野生组(505.29±187.01 cm vs.1038.26±173.75 cm,P0.01)和(381.27±139.72 cm vs.1156.47±342.17 cm,P0.001)。在37℃和39.5℃分别孵育后,基因敲除小鼠在旷场中心活动时间显著低于野生型小鼠(13.41±8.16 s vs.53.29±7.31 s,P0.001)和(10.18±5.27 s vs.55.73±6.61 s,P0.001);敲除组小鼠在旷场中总的站立次数显著低于野生组(22.78±5.72 vs.163.47±51.28,P0.0001)和(26.37±7.13 vs.121.37±22.79,P0.0001)。5.新物体识别实验结果显示,在37℃和39.5℃孵育加热后,基因敲除组小鼠和野生组小鼠对左、右两个相同物体均有访问且探索时间无显著性差异(WT:59.27±11.41 s vs.61.39±8.74 s,P0.05;WT+39.5℃:57.16±7.79 s vs.63.25±9.17 s,P0.05;GABRG2 KO:63.30±6.19 s vs.60.31±7.33 s,P0.05;GABRG2 KO+39.5℃:59.72±6.93 s vs.62.33±7.83 s,P0.05);对新放入的物体,野生组小鼠表现出更明显的兴趣,探访时间显著高于熟悉的物体(WT:27.54±9.37 s vs.64.62±7.40 s,P0.01;WT+39.5℃:21.39±6.62 s vs.62.57±8.68 s,P0.01),而基因敲除小鼠则对新放入的物体与熟悉的物体无显著性差异(GABRG2 KO:49.61±8.73 s vs.52.37±5.73 s,P0.05;GABRG2 KO+39.5℃:51.32±5.92 s vs.54.21±5.33 s,P0.05)。6.新位置识别实验结果显示,在37℃和39.5℃孵育加热后,基因敲除组小鼠和野生组小鼠对左、右两个相同物体同一水平位置均有访问且探索时间无显著性差异(WT:53.47±5.27 s vs.55.14±5.73 s,P0.05;WT+39.5℃:58.19±6.16 s vs.55.14±7.20 s,P0.05;GABRG2 KO:57.21±5.36 s vs.54.29±5.71 s,P0.05;GABRG2 KO+39.5℃:49.97±6.72 s vs.52.31±7.37 s,P0.05);将其中一个物体放置新位置后,可观察到野生组小鼠对新位置的同一物体探访时间更长(WT:21.73±5.29 s vs.71.62±8.31 s,P0.001;WT+39.5℃:20.77±8.24 s vs.66.48±6.73 s,P0.001),而基因敲除小鼠则对新位置的物体与熟悉位置的物体探访的时间无显著性差异(GABRG2 KO:48.33±10.73s vs.53.37±9.21 s,P0.05;GABRG2 KO+39.5℃:49.92±7.87 s vs.53.21±6.33 s,P0.05)。7.三箱社会交互实验结果显示,在37℃和39.5℃孵育加热后,基因敲除组小鼠和野生组在第一实验熟悉阶段无显著性差异,所有组小鼠均出现明显的社会交互意愿,与陌生者的接触时间均多于空白者(WT:87.60±11.18 s vs.23.46±8.57 s,P0.001;WT+39.5℃:90.33±6.39 s vs.19.14±8.77 s,P0.001;GABRG2 KO:79.24±13.26 s vs.23.10±7.71s,P0.001;GABRG2 KO+39.5℃:77.38±7.23 s vs.29.46±9.04 s,P0.001)。当空白笼子放入不同窝别陌生的新小鼠时,基因敲除组小鼠和野生组在第二实验社交新颖性阶段表现出明显差异,野生组小鼠表现出更明显的社会交互,与新小鼠的接触时间多于熟悉者(WT:88.13±12.37 s vs.25.10±6.44 s,P0.001;WT+39.5℃:90.71±9.22s vs.21.37±9.77 s,P0.001;GABRG2 KO:33.71±9.83 s vs.30.27±8.53 s,P0.05;GABRG2 KO+39.5℃:29.71±8.14 s vs.26.31±7.57 s,P0.05)。结论利用Cre/Loxp技术成功构建了海马与新皮质GABRG2基因敲除小鼠,其热诱导癫痫发作敏感性更高;基因敲除小鼠认知功能下降。


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