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靶向LncRNA HOTAIR的反义显像初探

任炯羽  
【摘要】:目的长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)HOTAIR(HOX transcript antisense RNA)在人类许多肿瘤中扩增和过表达,可作为肿瘤治疗的有效靶点。~(99m)Tc标记的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASON)可显示HOTAIR的表达,对恶性肿瘤有诊断和治疗价值,为恶性肿瘤的发生及预后提供重要的信息。本研究旨在用放射性核素~(99m)Tc合成一种新型的靶向LncRNA HOTAIR的反义寡核苷酸探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON,鉴定探针在体内体外的理化性质、探讨其经过脂质体转染后对人脑胶质瘤U87细胞增殖和迁移能力的影响,并对恶性胶质瘤荷瘤裸鼠进行体内生物分布及活体成像研究。方法设计并合成针对LncRNA HOTAIR的反义寡核苷酸(ASON)探针序列为5′-AATTCTTAAATTGGGCTGG-3′以及错配反义寡核苷酸(ASONM)探针序列5′-AATACTTAGATTAGGCAGG-3′。序列通过甲基化及硫代修饰以提高稳定性和抗降解能力,以NH_2C_6作为连接子,即合成结构式为5′-NH_2C_6-ASON-3′,通过双功能螯合剂HYNIC和Tricine缓冲液偶联~(99m)Tc。以相同的方法标记错配反义寡核苷酸,经Sephadex G25纯化后,利用ITLC纸层析法,以盐水为展开剂检测高峰管探针的标记率、放化纯、在新鲜人血清中的稳定性;琼脂糖凝胶电泳实验检测探针的抗降解能力。复苏恶性胶质瘤U87细胞株,以脂质体2000转染放射性标记的探针,利用γ放射免疫计数器测定肿瘤细胞对探针的摄取率;细胞划痕试验及CCK-8(Cell Counting Kit-8)试验分别检测转染探针后肿瘤细胞迁移及增殖能力的变化。此外,扩增培养U87细胞,以1×10~(10)个细胞,1.5ml每只小鼠接种于裸鼠右前腋下,待肿瘤直径达1.5-2.0cm左右时,选取肿瘤大小无显著差异、形态规则的荷瘤裸鼠用于后续实验。生物分布实验,取20只荷瘤裸鼠随机分为五组,分别经鼠尾静脉注射脂质体包裹的反义探针(即Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASON),脂质体包裹的错配探针(即Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASONM)1μg,2.59MBq(100μL),于注射后1h、2h、3h、4h、6h(错配组2h、4h)分别取一组荷瘤裸鼠进行脱颈处死,取心、肝、脾、肾、胃、小肠、膀胱、肌肉、骨、肿瘤进行称重并测量放射性计数;显像实验,取4只荷瘤裸鼠随机分反义显像组、错配组、阻断组和~(99m)Tc对照组。反义组与错配组分别注射4μg,14.8MBq(150μL)Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASON、Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASONM;阻断组在注射Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASON 2h前注射10μg脂质体转染的未标记探针;~(99m)Tc对照组注射与实验组相同放射性活度的~(99m)Tc溶液,四组分别于注射后1h、2h、4h、6h、8h进行SPECT显像,观察肿瘤部位的放射性摄取情况。所有数据采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组比较用T检验,多组比较采用方差分析。显著性判断标准:当P0.05时,说明受检组数据之间的差异有统计学意义。结果(1)ITLC测定反义探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON和错配探针~(99m)Tc-HYNIC-ASONM的标记率分别为(91±1.5)%和(90±0.6)%,放化纯度经检测均大于89%;凝胶电泳实验证实~(99m)Tc与探针成功标记并且没有发生明显的降解;经ITLC检测,探针在与生理盐水和人新鲜血清中孵育表现出良好的稳定性,且12h内放化纯度高于80%。(2)此外,细胞摄取实验表明脂质体具有携带探针进入细胞的能力,与未转染的探针相比(0.6%),脂质体转染后的探针在肿瘤细胞中的最大摄取率为3.0%,差异有统计学意义(t=15.6~21.56,P0.01);CCK-8实验、细胞划痕实验结果显示,转染探针Lip-~(99m)Tc-HYNIC-ASON能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力,与未转染组探针相比,差异均具有统计学意义(t=2.336~30.23,P0.05;t=51.54,P0.01,F=331.8,P0.01)。(3)生物分布研究表明,脂质体包裹的反义探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON在肿瘤中高度聚集,且肿瘤摄取明显高于错配组,肿瘤与肌肉的比值也明显高于错配组。同时,注射脂质体包裹的反义探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON后1h SPECT/CT显像可获得清晰的肿瘤部位浓聚影,2h时显影最为清晰;错配组和阻断组则均未见肿瘤显影。结论靶向HOTAIR恶性胶质瘤的反义寡核苷酸探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON可成功制备,该探针标记率高、稳定性良好,靶向结合能力强,能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和迁移,并且该脂质体包裹的反义探针~(99m)Tc-HYNIC-ASON可用于体内恶性胶质瘤中lnc RNA HOTAIR的实时显像,观察HOTAIR的表达,是一种新型的无创性靶向探针,有望用于恶性胶质瘤的早期和特异性诊断。


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