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阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合在结直肠癌进展中的作用机制探究

杨小娟  
【摘要】:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC),是威胁人类生命最常见的癌症之一。尽管外科手术、放化疗及生物治疗在CRC的防治中取得了长足的进展,但CRC的预防和治疗依然面临着巨大的挑战。阿司匹林(Aspirin,ASA),是一种广泛应用于慢病防治的非甾体类抗炎药,被证实在CRC的防治中有很好的疗效,但其作用机制仍不清楚。此外,肠道菌群失调与CRC密切相关,益生菌制剂可通过调控肠道菌群抑制CRC。本课题旨在探讨阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合应用通过调控肠道菌群、重塑免疫微环境,减缓CRC进展的作用效果及其可能的机制,为CRC的综合防治扩展新的思路、提供一定的理论依据和实验数据。第一部分阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合干预CRC的作用效果及机制目的明确阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合应用在CRC中的作用效果及机制方法采用AOM/DSS的方法诱导CRC小鼠模型,给予小鼠含400 mg/kg阿司匹的AIN-93G饲料以及灌胃法给予小鼠益生菌制剂。通过评估小鼠的死亡率、肿瘤体积、肠组织破坏程度等指标,确定阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用在CRC中的作用效果;并通过检测肿瘤组织中凋亡蛋白的变化,探索阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用在CRC中的作用机制。1.结直肠癌小鼠模型的建立:通过AOM/DSS的方法构建CRC小鼠模型,AOM采用10mg/kg的剂量进行单次腹腔注射,一周后让小鼠饮用含1.5%的DSS水五天,然后换用正常水两周,两周后再次饮用含1.5%的DSS水,循环三次。2.益生菌制剂的配制:通过本课题组前期的试验数据,选择益生菌制剂的有效成分,根据预试验结果确定相应的比例,将所需成分在三维混合器中充分混合后储存在-20°C冰箱。使用前,将益生菌制剂完全溶解于生理盐水中。3.组织标本的采集:处死小鼠后,取出小鼠的结直肠组织,记录肿瘤数目,并使用游标卡尺测量肿瘤大小。手术切除肿瘤,一部分放入冻存管储藏于液氮罐中,用于肿瘤组织学研究;另一部分用4%的多聚甲醛固定,用于HE染色的标本制备。4.病理组织的处理:将放入4%多聚甲醛中的结直肠组织固定24小时后,包埋、切片后进行HE染色。5.凋亡机制的探究:Western blot检测结直肠癌组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果1.阿司匹林、益生菌制剂能有效提高CRC小鼠的生存率。其中CRC小鼠的生存率由高到低依次为阿司匹林干预组、益生菌制剂干预组、阿司匹林联合益生菌制剂干预组、未干预组。2.阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用能减小CRC小鼠的肿瘤体积。其中肿瘤体积的变化由大到小依次为阿司匹林干预组、益生菌制剂干预组、阿司匹林联合益生菌制剂干预组。3.HE的结果表明,阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用都能有效降低CRC小鼠结直肠肠组织的破坏程度。4.阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可有效促进CRC小鼠肿瘤组织中BAX蛋白的表达。其中BAX蛋白表达的高低程度依次为阿司匹林干预组、益生菌制剂干预组、阿司匹林联合益生菌制剂干预组。结论阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可有效减缓结直肠癌的进展。这种作用主要是通过上调肿瘤细胞中BAX蛋白的表达,通过诱导肿瘤细胞发生凋亡,进而达到减缓结直肠癌的效果。第二部分阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合对小鼠肠道菌群的影响目的探讨阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合应用调控肠道菌群减缓CRC进展的机制方法采集阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合应用干预CRC小鼠后在第4、7、10以及第13周时的粪便,通过扩增子测序的方法探讨肠道菌群的变化。1.通过Venn图和PCoA分析,解释阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用对CRC小鼠肠道菌群结构的影响。2.采用门水平(Phylum)丰度聚类热图、属水平(Genus)物种相对丰度柱形图以及种(Species)水平上的丰度比较图,从不同水平揭示阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用对肠道菌群在门、属、种水平的具体影响。结果1.Venn图表明,在不同时间点,RA组(结直肠癌小鼠阿司匹林干预组)、CP组(结直肠癌小鼠益生菌制剂干预组)以及CPA组(结直肠癌小鼠阿司匹林联合益生菌制剂干预组)与NC组(正常小鼠未干预组)共有的OTUs数目总是大于RC组(结直肠癌小鼠未干预组)与NC组共有的OTUs数目。即与未干预的小鼠相比,阿司匹林、益生菌制剂、阿司匹林联合益生菌制剂干预后的结直肠癌小鼠的肠道菌群组成更加接近正常小鼠的肠道菌群组成。PCoA分析显示,随着干预时间的延长,RA组、CP组和CPA组的肠道菌群与正常小鼠的肠道菌群之间的距离越来越近。以上结果表明阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可有效促进CRC小鼠的肠道菌群结构向正常小鼠的肠道菌群结构发展。2.阿司匹林、益生菌制剂以及阿司匹林联合益生菌制剂在不同时间点调控不同菌的变化。阿司匹林主要可以促进Firmicutes_bacterium_ASF500和Lactobacillus_reuteri,抑制Burkholderiales_bacterium_YL45和Clostridium_disporicum;益生菌制剂主要可以促进[Clostridium]_papyrosolvens,抑制Clostridium_perfringens和Erysipelatoclostridium_ramosum。两者的联合主要可以促进Firmicutes_bacterium_ASF500,抑制Burkholderiales_bacterium_YL45、Ruminococcus_sp_5_1_39BFAA以及Enterococcus_faecalis。3.通过对丰度变化具有差异的物种进行再次统计分析,以物种丰度为纵坐标,组别为横坐标绘制折线图,在阿司匹林和益生菌制剂干预的组里找出了几种变化具有规律的菌作为干预引起的主要差异物种。阿司匹林作用的主要差异物种是Clostridiales_bacterium_CIEAF_013,益生菌制剂作用的主要差异物种是Bifidobacterium_animalis和Clostridium]_cocleatum。结论阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用,通过调控CRC小鼠的肠道菌群结构,促进CRC中的有益菌,抑制有害菌,进而达到减缓CRC的目的。第三部分阿司匹林、益生菌制剂及两者的联合对小鼠免疫微环境的影响目的探讨阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用重塑CRC小鼠的免疫微环境,减缓CRC进展的作用机制。方法通过颈椎脱臼法处死小鼠,摘取小鼠的脾脏,并提取单个核细胞。采用流式细胞术检测CD4~+CD~25+Treg、CD4~+IL-4~+Th2、CD~19+GL-7~+B细胞的比例以及免疫共抑制分子TIGIT的表达变化。结果1.与正常小鼠相比,结直肠癌小鼠的CD4~+CD~25+Treg细胞显著升高,阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可有效下调CRC中升高的CD4~+CD~25+Treg细胞。2.与正常小鼠相比,结直肠癌小鼠的CD4~+IL-4~+Th2细胞的比例显著降低,同时其表达的TIGIT显著升高。阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可有效上调CRC中降低的CD4~+IL-4~+Th2细胞的比例,下调免疫共抑制分子TIGIT的表达。3.与正常小鼠相比,结直肠癌小鼠的CD~19+GL-7~+B细胞数量显著下降,益生菌制剂可有效上调CRC中减少的CD~19+GL-7~+B细胞的数量。结论1.在CRC的免疫微环境中,CD4~+CD~25+Treg细胞高表达,抑制了CD4~+IL-4~+Th2细胞的数量和功能,导致CD~19+GL-7~+B细胞的数量减少,促进了CRC的进展。2.阿司匹林、益生菌制剂以及两者的联合应用可重塑CRC小鼠的免疫微环境,通过抑制CD4~+CD~25+Treg细胞的比例,下调TIGIT促进效应性T细胞CD4~+IL-4~+Th2细胞的数量和功能,减缓CRC的进展。益生菌制剂减缓CRC的进展也与上调CD~19+GL-7~+B细胞的数量有关。


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