口蹄疫病毒vp1体外表达和DNA疫苗免疫效果的研究

【摘要】：口蹄疫(foot and mouth disease, FMD) 是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物多发 的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。目前，针对预防口蹄疫疾 病的爆发和流行，多数发展中国家主要采用注射病毒灭活疫苗的方法。但灭活 疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此，新型口蹄疫疫苗及免疫策略的 研究已成为亟待解决的焦点。本研究主要开展 O 型口蹄疫病毒（新疆株）vp1 基因的真核酵母表达、化学佐剂及蛋白疫苗和核酸疫苗联合免疫增强 FMDV vp1 DNA 疫苗免疫效果的研究。 将FMDV vp1 基因克隆到毕赤酵母Pichia pastoris 分泌性表达载体 pSuperY 中，获得酵母重组表达载体 pSuperY/vp1，经测序证明vp1基因序列的 正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后，用电转化法将pSuperY/vp1转化导 入毕赤酵母菌种SMD1168H中。对重组酵母表达产物用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析，并用酵母表达的FMDV VP1蛋白免疫小鼠。结果重组质粒 pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后能够表达相对分子量（Mr）为66,000 和 43,000 的FMDV VP1蛋白，动物免疫结果表明FMDV VP1蛋白能够诱导小鼠产生特异 性的体液和细胞免疫应答。 DNA 传递是基因表达与功能研究及其医学应用的重要技术，安全高效的 DNA 传递一直是研究者期待的目标。利用一种新的阳离子多聚物脱乙酰甲壳胺 -16 介导重组质粒 pcDNA3/vp1 转染 COS-7 细胞，RT-PCR 可检测到目的基因 vp1 在 mRNA 水平的表达，实时定量 PCR 结果表明其转染效率高于脂质体与磷酸 钙法，同时还对转染条件进行了探讨。DNA 结合分析发现脱乙酰甲壳胺-16 能 够与 DNA 形成核酸纳米颗粒，提高 DNA 稳定性，促进真核细胞转染效率的提 高。结果表明脱乙酰甲壳胺-16 确能做为一种新型的非病毒纳米 DNA 传递载体， 并将可能在基因表达与功能研究及基因治疗等领域发挥重要作用。 将 FMDV vp1 cDNA 克隆至真核表达载体 pcDNA3 上，体外酶切鉴定正 - 3 - WP=6 新疆大学硕士论文 确的重组质粒 pcDNA3-vp1 转染 COS-7 细胞，通过 RT-PCR 的方法确认重组 质粒在 COS-7 细胞中 mRNA 的表达。随后将 100μg 重组质粒 pcDNA3-vp1 分 别与 0.25%普鲁卡因、1%左旋咪唑、5%乙醇、1.5% Tween80 和 0.9% NaCl 混 合免疫接种小鼠，对照组注射质粒 pcDNA3，比较不同化学佐剂对小鼠免疫反 应的影响效果。结果发现重组质粒 pcDNA3-vp1 能够在真核细胞中有效的转录 表达；不同的化学佐剂与重组质粒混合免疫均可诱发小鼠机体产生针对 FMDV VP1 的特异性体液免疫和细胞免疫；1%佐旋咪唑实验组所诱发的 IgG2α 水平最 高，T 细胞扩增活性及 DTH 反应最强，说明 1%佐旋咪唑能够增强 DNA 疫苗 的 Th1 型免疫反应?。结果表明化学试剂左旋咪唑能够增强?DNA 疫苗的免疫效 果，可以作为新型高效的 DNA 疫苗的化学佐剂。 DNA 疫苗由于能同时诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫反应等优点， 已经成为研究者关注的焦点之一。但单独使用 DNA 疫苗在大动物体或人体只 能诱导低水平的免疫反应，必须利用佐剂或改进免疫策略等方法增强其免疫原 性。最近的研究发现，核酸疫苗触发，重组病毒疫苗或蛋白疫苗加强的 prime-boost 免疫策略能够明显的提高疫苗对动物的保护力。考虑到该方法在实 际应用时存在的不便，我们在研究中采用将质粒 DNApcDNA3-vp1 和口蹄疫灭 活疫苗或酵母重组 VP1 蛋白联合免疫的策略。结果 prime-boost 方法的确能够 同时提高小鼠和牛产生的针对 FMDV 的特异性体液免疫和细胞免疫；将 DNA 与蛋白混合同时注射后，虽然提高了抗体分泌水平，却抑制了动物体外 T 细胞 增殖和体内 DTH 等细胞免疫反应，特别是抑制了 Th1 型细胞因子的表达。