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莱茵衣藻遗传转化条件的优化及表皮生长因子基因的转化

张文平  
【摘要】:莱茵衣藻作为单细胞真核绿藻,具有生长周期短,实验操作简便,只具有一个较大的叶绿体,易获得各种突变体等优点,是国际上用于研究植物细胞分子生物学和光合作用遗传的理想模式材料。莱茵衣藻的遗传转化为获得大量突变体,并分离导致突变的基因以及研究其功能等提供了很有效的手段。为了研究光合色素相关基因的特性和莱茵衣藻在生物技术中的应用,本文对莱茵衣藻遗传转化的条件和cbn1 基因的遗传转化及表皮生长因子(EGF)基因在莱茵衣藻中的表达方面作了实验研究。 用玻璃珠研磨法将p389ARG7 转入到莱茵衣藻arg7 突变品系中,经过多次转化实验,结果显示,在TAP 培养基中琼脂粉的浓度为1.8%,用自溶素处理40分钟左右, 玻璃珠研磨时间为15秒,有利于提高莱茵衣藻的转化率,并且线性质粒并不比用环形质粒的转化率高。 为了克隆cbn1 基因,在上述条件下,用玻璃珠研磨法将p389ARG7 转入到莱茵衣藻缺壁及精氨酸依赖性的双突变体(cw15,arg7,mt-)中,经过多次转化共得到了3000多个转化子,经荧光检测,筛选到了两株叶绿素b 缺失突变体ART3和ART4,并用高效液相色谱对其进一步检测。 用玻璃珠研磨法将p387NIT1质粒转入到莱茵衣藻硝酸还原酶缺陷型及缺壁突变体(cw15,nit1-305,mt-)中,共获得不同的插入型突变转化子1800 多个,经荧光检测后,进一步用高效液相色谱法检测出缺乏叶绿素b 的一个突变子NIT17-1。这两种质粒在莱茵衣藻中的成功转化,不仅验证了玻璃珠研磨法的有效性,而且为克隆cbn1 基因制备探针打下了基础。 电击转化法是莱茵衣藻遗传转化的有效方法之一。根据文献查询,未见有关使用BIO-RAD165-2110 型电击仪对莱茵衣藻进行转化的报道。因此我们用此种电击仪对莱茵衣藻进行多次电击转化实验,结果显示,其最佳电压值为900V。 用藻类生产药用蛋白是基因工程中的一个重要领域。为了使表皮生长因子


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