口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,主要侵害猪、牛、羊等偶蹄类动物。该病传播速度快、宿主范围广、发病率高,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首。多数发展中国家通过注射疫苗的办法来控制该病的流行,因此如何区分自然感染动物和注射疫苗动物是该病防控中迫切解决的问题。FMDV感染动物既能产生结构蛋白(SP)抗体也能产生非结构蛋白(NSP)抗体,而现行灭活疫苗在生产过程中大多数去除了非结构蛋白,因此,动物在接种FMDV灭活疫苗后,主要产生结构蛋白抗体,很少或者不产生NSP抗体。所以,以NSP为抗原,检测动物体内NSP抗体是一种很好的区分自然感染动物和疫苗免疫动物的诊断方法。 本文以亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒为研究对象,通过逆转录并进行PCR扩增得到非结构蛋白3ABC基因,然后定向克隆到原核表达载体pET-32a,重组质粒pET-32a-3ABC转化宿主菌BL21和rosetta,并经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE检测,证明重组蛋白PET-32a-3ABC成功在大肠杆菌中表达。表达量较少,经过对3ABC序列进行分析,发现含有的稀有密码子较多,约占总数的30%,可能影响蛋白的表达。以构建的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC质粒pET-32a-3ABC为模板,设计特异性的引物,然后进行PCR扩增得到非结构蛋白3AB、3A基因,然后分别定向克隆到原核表达载体pET-28a、pET-41a两种载体上,将重组质粒转化宿主菌BL21,并经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE检测,证明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达产物经Western blot分析具有免疫原性。 本文用纯化3A蛋白作为抗原,建立了检测FMDV抗体的间接ELISA方法并确定了ELISA最佳工作条件。此项研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立鉴别诊断动物自然感染和免疫的间接ELISA方法奠定了基础。