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双峰驼瘤胃细菌多样性及宏基因组文库构建与初步筛选

张玲  
【摘要】: 瘤胃微生物在反刍动物营养物质消化吸收中起着举足轻重的作用,在饲料、瘤胃调控、食品发酵和生物质利用等领域中具有极大的应用潜力。本试验采用免培养技术分析新疆双峰驼瘤胃细菌多样性,明确其种群组成;构建宏基因组文库,并从中筛选有价值的功能基因,为今后进一步开发利用瘤胃微生物提供科学基础和技术平台。研究取得了以下结果: 研究建立了一种简便快速地从双峰驼瘤胃微生物细胞中提取总DNA的方法,采取冻融-酶-SDS相结合的直接提取法,提取得到的瘤胃微生物总DNA较完整,片段大于23 kb。 构建了双峰驼瘤胃细菌16S rDNA克隆文库,该文库的覆盖率达到57%,Shannon-Wiener index(H′)多样性指数为4.57。采用ARDRA技术分析该文库中的331个阳性克隆,得到130个可操作分类单元(OTUs)。分析结果显示在瘤胃内存在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门、TM7和未分类细菌,其中厚壁菌门为优势菌群,占63.8%。利用T-RFLP技术分析显示在双峰驼瘤胃内存在变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、柔膜菌门、绿弯菌门和浮霉菌门。研究结果说明两种方法结合可检测到的菌群种类更加丰富。经分析双峰驼瘤胃细菌与GeneBank数据库中已知序列相似性在85%-99%之间,相似率大于97%部分只占35.4%,未知序列占64.6%,表明双峰驼瘤胃细菌中只有少数为已知种,大多为未知的新属、种或潜在的其他新的分类单元;其中可培养细菌仅占5.4%,未培养占94.6%。 以经过酶切的瘤胃微生物总DNA为插入片段,以pBluescriptSK(+)为载体构建了质粒宏基因组文库。对424个克隆进行CMCase和β-1,4-葡萄糖苷酶活性筛选,初步筛选后,有30个克隆表现β-1,4-葡萄糖苷酶活性,有6个克隆表现CMCase活性,这些有活性的克隆还有待进一步分析鉴定。本研究结果为发掘双峰驼瘤胃微生物的生物功能、利用瘤胃微生物遗传资源提供了重要的技术平台。


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