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基于芯片杂交结果克隆疏叶骆驼刺、苦马豆相关基因的研究

赖黎丽  
【摘要】: 疏叶骆驼刺(Alhagi sparsifolia Shap.)是豆科骆驼刺属(Alhagi Gagneb.)多年生草本植物,耐旱、耐盐碱和抗涝强,是干旱区的优良牧草,也是很好的蜜源植物和药用植物。苦马豆[Swainsona salsula Taub. (Sphaerophy salsula (Pall.) DC.)]又名羊尿泡、马尿泡,是多年生豆科苦马豆属植物,是耐盐碱、抗涝强的植物,具有改良土壤及抗癌调节免疫活性的作用。 本实验通过对疏叶骆驼刺、苦马豆与截形苜蓿芯片杂交结果的分析,结合截形苜蓿生物信息学数据,从疏叶骆驼刺中筛选出非共生血红蛋白nSHb和甲酸脱氢酶FDH两个基因,从苦马豆中筛选出异黄酮还原酶IFR基因。 我们分别提取疏叶骆驼刺和苦马豆的总RNA,利用oligo dT反转录为cDNA,然后根据截型苜蓿GenBank中nSHb、FDH和IFR的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增出三个基因的全长cDNA序列,分别命名为AsnSHb,AsFDH和StIFR。其中,AsnSHb基因长度为483bp,编码160个氨基酸;AsFDH长度为1170bp,编码389个氨基酸;StIFR长度为957bp,编码318个氨基酸,通过与苜蓿序列的同源性比较,发现基因序列的同源性分别为92.50%、89.41%和81.82%,翻译蛋白的同源性分别为91.51%、92.03%和83.39%。并且构建了表达载体,通过农杆菌转化的方法将这三个基因分别转到烟草和拟南芥中,为进一步验证nSHb、FDH和IFR基因所编码蛋白的相关功能奠定基础。 设计5’端带有BglⅡ和3’端带有SpeⅠ酶切位点的引物,利用PCR技术分别扩增AsnSHb、AsFDH和StIFR基因编码区,然后插入到pCAMBIA1_30_2载体的BglⅡ和SpeⅠ位点上构建表达载体,双酶切鉴定后将该载体转入农杆菌EHA105,用利福平抗生素进行筛选,并且通过农杆菌转化的方法分别将这三个基因转到烟草和拟南芥中。


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