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新城疫病毒单克隆抗体的建立及其遗传变异分析研究

曲鲁江  
【摘要】: 本文分为两部分,前一部分试验是制备用于新城疫病毒(NDV)遗传变异分 析的NDV单克隆抗体(McAb)及其生物学特性的鉴定,后一部分试验是通过对 两株NDV F基因的克隆及序列测定,对其进行遗传变异分析,从而确定二者 在NDV遗传进化过程中所处的位置。 用蔗糖密度梯度离心纯化的标准强毒F_(48)E_9作为抗原,免疫BALB/C小鼠, 按常规的方法进行细胞融合、克隆,经反复验证,得到能稳定分泌抗体并产 生腹水的杂交瘤细胞六株。经鉴定,其中有五株McAb是血凝素-神经氨酸酶 (HN)的McAb,只有一株是融合蛋白(F蛋白)的McAb,各株McAb腹水的 ELISA效价均在1/10~3以上,HN蛋白的McAb具有较高水平的血凝抑制(HI) 价,F蛋白的McAb具有较高水平的病毒中和作用及蚀斑形成抑制作用。 经实验验证,应用单克隆抗体检测不同来源的NDV时,细胞ELISA方法 具有经济、有效的特点。因此,确定该方法是可行的。 从江西、云南两地区爆发新城疫鸡病料中经分离到两株新城疫病毒,并 将其命名为:FJ1、FY1。两个毒株经血凝和血凝抑制试验初步鉴定后,采用 蚀斑纯化方法,选择出引起新城疫发生的主导毒株,尤其排除疫苗毒株。对 分离后的毒株进行生物学特性鉴定,如最小致死量致死鸡胚平均死亡时间 (MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)和血凝谱测定,并进一步对F 基因部分片段克隆测序,分析各毒株遗传变异情况。 蚀斑纯化表明,在无胰酶和镁离子存在的情况下,低毒力的新城疫病毒在 细胞培养物上不能形成蚀斑,强毒和中等毒力的毒株均可形成蚀斑。MDT和 ICPI测定结果表明,所分离的两个毒株MDT、ICPI均达强毒标准,说明都 是强毒。 根据NDV F基因起始密码子前的非编码区和上游区段的序列设计一对引 物,这对引物可扩增出F基因上游区段的908bp片段。采用此引物对这两个 毒株进行 RTFCR扩增后,将 PCR产物重组到 pUC载体上。核昔酸序列 测定结果表明,两个毒株 F蛋白的裂解位点氨基酸组成为:‘’‘gQR(K)RF‘”, 具有强毒株裂解位点氨基酸组成,说明都是强毒株,这与 MDT和 ICPI测定 结果相吻合。选择l刁 核苦酸序列,对本试验两个和国内现已克隆测序 的H十多个NDV毒株(郭慈,1999;梁荣,1999)以及国外部分毒株共86 株绘制基因系统发育进化树。结果表明刊 归属于基因型 Vll,FY归属于基 因型h。从我国己分离毒株基因分型来看,分别归属于基因型爪VI、Vll、 i、IX,其中IX和皿基因型是我国新近发现的,说明我国新城疫病毒既有国 外流行基因型,还具有自身特有基因型,同时可以看出各基因型具有一定的 时间和地域特点。


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