抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用研究

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患的烈性传染病,也是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,人和动物一旦发病,死亡率高达100% ,所以至今仍被人们广泛关注。 抗狂犬病病毒(RV)单克隆抗体是研究狂犬病病毒诊断方法,治疗及预防狂犬病的有利工具。为了获得高效价、高特异性的抗RV 单克隆抗体,并将其应用于荧光检测。本实验将RV SRV9 毒株接种乳鼠,发病后收集鼠脑,经匀浆离心收取上清,RT-PCR 分析,TCID50测定证明,产物中含有高效价狂犬病病毒。以上述病毒免疫Balb/c 小鼠,取脾细胞和SP2/0 骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA筛选,经有限稀释法克隆3 次,最终获得15 株稳定分泌抗RV 抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为C1、C2、C3、C4……C15。 将15 株单抗的杂交瘤细胞株接种Balb/c 小鼠腹腔生产单抗腹水,ELISA 测定其效价达l:2×103-l.6×106 。间接ELISA 和Western-blotting 试验结果表明,15 株单抗均与RV SRV9 全病毒抗原反应,与不同科病毒犬瘟热病毒(CDV),犬细小病毒(CPV),犬腺病毒(CAV)和水疱性口炎病毒(VSV)均不发生交叉反应,显示这15 株单抗对RV 具有良好的特异性;其中C1、C4、C8、C9、C10、C13、C15 单抗可与SRV9、8202、CVS 3 个毒株反应,表明他们是针对狂犬病病毒共同抗原决定簇的单抗。单抗C1、C2、C5、C8、C9、C15 属于IgG2a 亚类抗体,单抗C4、C10、C13 属于IgG1亚类抗体,其余6 株单抗均为IgG2b 亚类抗体。 将单抗腹水纯化后用FITC(异硫氰酸荧光素)标记,通过荧光灶抑制试验,对犬血清中的RV抗体进行检测并确定其效价。经过对已知RV 阳性血清、已知RV 阴性血清和待检血清样品检测结果表明,该方法具有敏感、特异和方便快速等优点。