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南瓜抗黄瓜花叶病毒(CMV)基因的RAPD分子标记筛选

周辉  
【摘要】:近年来随着南瓜栽培面积的不断扩大,以CMV 为主的南瓜病毒病的危害也日益加重,特别在高温干旱年份发病较多,引起了严重的质量和产量损失。南瓜病毒病的典型症状为皱缩有疮斑、甚至扭曲,病叶畸形,植株矮化,花叶叶片上出现淡绿色和深绿色相间的斑驳,有的斑驳明显黄化。CMV 由60 多种蚜虫以非持久性方式传播,药剂防治成本高、效果差,并且污染产品和环境。培育抗病品种被认为是最有效、无环境污染和可持续发展的途径。因此,深入了解抗病毒病基因的遗传效应,获得其遗传模式的信息,并能将其导入优良品种是很有必要的。而分子标记技术是抗性基因筛选和鉴定的最有用工具之一。 本研究以南瓜抗病与感病亲本杂交后自交所得的F2 群体为材料,采用分离群体分析法(Bulked segregant Analysis, BSA ),筛选与抗性基因连锁的RAPD 分子标记,进行分子标记辅助育种,主要结果如下: 1. 应用电子显微镜负染法观察了病原粒体的形态;利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)鉴定了侵染本试材的主要病原种为CMV。 2. 进行了田间自然诱病鉴定,结果显示F1 代均发病,F2 代的抗感分离比为1:3,计算的χ2= 0.0176,小于χ20 05(df=I) =3.84。这表明本研究所选用的这份抗性材料对CMV 的抗性应该存在主效基因控制且为一对隐性基因。 3. 为确保南瓜RAPD 反应结果的稳定性和重复性,本文对影响南瓜RAPD 分析结果的退火温度、PCR 反应循环数、MgCl2、dNTPs,Taq 酶、引物、模板浓度等重要因素进行了初步研究。最终优化的南瓜RAPD 反应体系为:25μl 反应液中:10×反应buffer(100 mmol/L Tris-HCL,100 mmol/L KCL, 80 mmol/L (NH4)2SO4 ,pH=9.0,NP-40)2.5μl, 3mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,Taq 酶l.0U,引物15 ng/μl ,DNA 模板10 ng/μl 。本研究最终确立的PCR 反应程序为: 94℃预变性5min,然后按94℃变性30s,37℃退火30s,72℃延伸90s,进行40 个循环,最后72℃延伸5min。 4、以K01,K02 及其F2 代群体76 株植株为材料,利用分离群体分析法(BSA)进行抗CMV 基因定位,通过520 个随机引物和310 组双引物的RAPD 扩增分析,发现有6%的单引物和5%的双引物在抗感池之间表现多态性,共找到了两个与南瓜抗CMV 亲本K01 中的抗病基因相连锁的分子标记S4391400和S19+S345600。这两个标记与K01 的抗病基因的重组率分别为7.5%和11.8%,遗传距离分别为7.1cM 和11.7cM。


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