羊痘病毒P32基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【摘要】： 羊痘病毒(Capripoxvirus, CPV)能分别引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病。羊痘(绵羊痘和山羊痘)被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病,我国将其列为一类动物疾病。羊痘病毒P32蛋白是CPV具有很好保守性的主要结构蛋白,且含有主要抗原决定簇。 本研究采用PCR技术扩增出CPV P32基因,将其克隆至pMD18-T载体。经酶切鉴定、PCR分析证实获得了与预期片段大小一致的P32基因,将其测序分析后与GenBank中AF124517株相比较,同源性为98.2%,与AY159333株相比较,同源性为99.4%。用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ将P32基因从重组克隆载体pMD18-P32中切下后与相应限制性内切酶酶切过的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K相连接,构建了重组表达载体pPIC9K-P32。将重组表达载体pPIC9K-P32电转化毕赤酵母菌种GS115,将P32基因亚克隆至pPIC9K,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株。对重组菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析诱导表达的上清中含有分子量约为30ku的目的蛋白,Western-blot分析表明,此蛋白具有反应原性。