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减毒羊痘病毒基因复制非必需片段的筛选与鉴定

施程洪  
【摘要】: 羊痘(山羊痘和绵羊痘)是由羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)感染山羊和绵羊等偶蹄动物引起的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,我国将其列为一类传染病。 当前痘病毒活载体疫苗的研究是一个热点。痘病毒因其具有特异性,含有大量的复制非必需片段可以插入大片段的外源基因等特点而引起了研究者的高度重视。羊痘病毒基因组全长150Kb,基因组结构相当庞大,含有多个复制非必需区,可以供多种免疫源基因的插入,进而构建成双价、多价疫苗。而构建羊痘病毒活载体疫苗,其首要的工作就是要进行复制非必需片段的筛选。本研究通过随机克隆的方法,将提纯后的羊痘病毒基因组HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中。通过限制性内切酶片段电泳分析和序列测定分析结果表明,克隆得到6个不同大小的HindⅢ片段PUA、PUB、PUC、PUD、PUE、PUF。将它们和Genebank中登录的羊痘野毒株Pellor(AY077835)株进行同源性比较,核苷酸同源性达到90%以上。选取克隆或亚克隆后的单一的酶切位点,插入P_(11)P_(7.5)-LacZ报告基因构建了PUA1、PUB1、PUC1、PUD1、PUE1、PUF1六个重组载体质粒,转染羊痘病毒感染的BHK-21细胞。在X-gal存在条件下通过蓝白斑筛选重组病毒的方法,筛选出了1个复制非必需片段,为进一步构建表达外源片段重组质粒载体奠定了基础。


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