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海岛棉(G.barbadense L.)茎尖再生体系的建立及农杆菌介导抗虫基因(Bt;SATI)转化研究

翁琴  
【摘要】: 本实验以海岛棉新海20,新海16,K222,97006为转化受体品种(系),采用农杆菌介导法将抗虫基因BT、SATI转化棉花茎尖外植体。通过对影响组织培养和转化的相关因素的研究,建立起了适宜于海岛棉的农杆菌介导的茎尖遗传转化体系。本研究为海岛棉转基因育种提供了技术支持。主要研究结果如下: 1.建立了海岛棉茎尖再生体系。无菌条件下,脱绒种子用70%乙醇浸润30S,再经过0.1%的升汞消毒10min后,用无菌水冲洗3-5次,28℃,浸种12-16h至“露白”,剥去种皮在自来水发芽培养基上生长。以MSB5(即MS1)为基本培养基,取不同苗龄茎尖在附加不同浓度激素的培养基中继代培养,对不同的培养基进行筛选优化。在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L与1/2MSB5+IBA 0.1 mg/L再生效果较好;同时,结果表明,棉花茎尖诱导成苗时,基因型之间差异不显著。 2.建立了以海岛棉茎尖为受体的转化体系。通过对影响转化频率相关因子的研究,以及对头孢霉素(Cef)抑菌浓度、卡那霉素(Kan)筛选浓度、农杆菌菌株的比较筛选,证明了海岛棉茎尖可做为良好的受体材料并且获得了根癌农杆菌介导的海岛棉茎尖转化体系:未经预培养的带下胚轴0.5-0.8cm的茎尖在OD600=0.8的根癌农杆菌菌液中浸染20-30min,共培养48-72h;选择培养以200mg/LCef为抑菌浓度,150mg/LKan为最高筛选浓度;两种菌株比较结果EHA105的侵染转化率高于LBA4404。 3.转基因植株的PCR检测 对抗性植株进行PCR扩增检测,得到了与阳性对照Bt(1080bp)目的基因相同的特异性片段,转化率达到0.7%。将转基因植株嫁接定植成活。由此,从分子水平上初步证明外源抗虫基因已经整合到了再生植株的基因组中。


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